Changes of intestinal microbiota and ivabradine biotransformation in rats after alcohol introduction

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

The role of intestinal microbiota in progress of many pathological processes is discussed in recent publications. It was shown that the continuous intestinal dysbiosis, including the increased bacterial growth syndrome, affects the digestion and the biotransformation of xenobiotics. Intestinal microbiota provokes metabolic failures leading to severe diseases acting via several mechanisms. Alcohol is found to be a common dysbiotic factor and toxic agent affecting the systems of biotransformation. This study was to estimate the associations between the intestinal microbiota and the biotransformation of ivabradine, CYP3A4 substrate, in rats during the chronic alcohol intake. The study used 30 male Wistar rats divided into two groups – control and experimental, administrated 15% ethanol as a sole water supply during 40 days to model the chronic alcohol intake. The decrease of bifido- and lactobacterium spp. found in experimental group correlated with excretion and metabolic ratio of ivabradine metabolite and ivabradine in urine. These findings demonstrate the participation of intestinal microbiota in the metabolism of ivabradine after oral introduction.

Full Text

Актуальность исследования

Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) человека населен многочисленными микроорганизмами, метаболизм которых тесно интегрирован в метаболизм макроорганизма [1]. В 2006 г. R. Goodacre введено понятие «суперорганизм», под которым понимается сообщество человека и населяющих его микроорганизмов [2], причем доля собственно человеческих клеток в нем составляет всего лишь 10%, а 90% принадлежат бактериям [3]. Исследования последних лет существенно изменили стандартные представления о роли кишечной микробиоты в патогенезе многих заболеваний [4]. Хорошо изучена одна из важнейших метаболических функций кишечной микробиоты, связанная с синтезом короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК): уксусной, пропионовой, масляной, валериановой, капроновой кислот и их изомеров. Образующиеся в результате анаэробного (бифидобактерии, пропионибактерии, бактероиды и др.) брожения доступных для бактерий ди-, олиго- и полисахаридов КЦЖК определяют снижение рН, обеспечивают колонизационную резистентность, а также принимают участие в регуляции кишечной моторики и всасывание некоторых ионов, таких как кальций, магний, железо, необходимых для поддержания водно-электролитного баланса в организме [5; 6]. В многочисленных исследованиях показана важная роль микробиоты кишечника, т.к. она участвует в иммуностимуляции, синтезе витаминов группы В и витамина К, никотиновой и фолиевых кислот, различных биологически активных соединений: эстрогенов, промазина, морфина, колхицина, дигоксина, регулировании моторики и других функций ЖКТ. Таким образом, кишечный биоценоз поддерживает значительное число биохимических процессов организма и сравнивается по значимости с печенью [7].

Состояние микробного дисбаланса (дисбиоза) характеризуется изменением качественного и/или количественного состава кишечной микробиоты. Наблюдаемые изменения могут включать выраженное сокращение количества представителей пробиотических штаммов (бифидобактерии, лактобактерии) и повышение патогенной протеолитической микробиоты, являющейся маркером дисбиотических нарушений, под воздействием которой образуются продукты распада белков и аминокислот – индол, скатол, фенол и др. [8]. Данные соединения, в свою очередь, вместе с микробными токсинами (экзо- и эндотоксины) и различными факторами патогенности микроорганизмов (патогенных, условно-патогенных, непатогенных) выступают в качестве источников эндотоксинемии [9]. Совокупность описанных нарушений лежит в основе развития синдрома эндогенной интоксикации (ЭИ).

Алкоголь приводит к избыточному бактериальному росту и способен существенно изменить количественный и качественный состав микробиоты кишечника [10]. J.C. Bode и соавт. показали, что почти у половины больных алкоголизмом в аспирате тощей кишки обнаружено увеличение общего числа бактерий с преобладанием анаэробных микроорганизмов [11; 12]. Этанол является одновременно источником энергии и сильным фармакологическим агентом. Первичное поражение систем детоксикации в результате непосредственного влияния этанола, а также их вторичное поражение токсическими продуктами извращенного метаболизма приводят к изменению гомеостаза [9]. В результате происходит взаимное усиление процессов, приводящих к ЭИ.

Анализ приблизительно 78 млн базовых пар последовательностей ДНК из фекальных образцов здоровых взрослых людей показал, что кишечный микробиом активно участвует в метаболизме глицинов, аминокислот, ксенобиотиков [13]. Метаболический ответ организма на эндотоксемию заключается в индукции ферментов, отвечающих за метаболизм ксенобиотиков. Окисление происходит за счет микросомальных оксидаз смешанного действия при участии НАДФ, кислорода и цитохрома Р450 [14, с. 119]. Система цитохрома P450 участвует в нейтрализации многочисленных соединений как экзогенного, так и эндогенного характера. Его индукторы: глюкокортикоиды, фенолы, индолы – участвуют в биотрансформации большого числа лекарственных веществ. Одна из самых распространенных реакций окисления ксенобиотиков цитохромом Р450 – окислительное деалкилирование, сопровождающееся окислением алкильной группы, присоединенной к атомам N, O или S [15]. Этот процесс происходит в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) гепатоцитов.

Индукция ферментов, отвечающих за метаболизм ксенобиотиков, может приводить к снижению эффективности лекарственной терапии, поэтому оценка вклада эндогенной интоксикации, возникающей при дисбиотических процессах на фоне хронического употребления алкоголя, является важной задачей клинической фармакологии.

Цель исследования

Изучить взаимосвязь дисбиотических процессов и особенностей биотрансформации ивабрадина, субстрата изофермента CYP3A4, при хронической алкоголизации крыс.

Методика исследования

Клинико-лабораторные исследования выполнялись в Волгоградском государственном медицинском университете на базе лаборатории геномных и протеомных исследований Волгоградского медицинского научного центра. Исследование влияния хронической алкоголизации на дисбиотические процессы и систему цитохрома Р450 печени проведены in vitro и на экспериментальных животных. Работа выполнена на 30 крысах-самцах стока Wistar (280–350 г.), содержавшихся в стандартных условиях вивария с соблюдением всех правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований на территории РФ, в НИИ фармакологии ВолгГМУ.

Животные были распределены на 2 группы: контрольную, содержавшуюся на стандартном водно-пищевом рационе, и экспериментальную, с 15% этанолом как единственным источником жидкости на протяжении 40 суток [16; 17].

Оценка микробиологического статуса кишечника крыс производилась до начала эксперимента (по истечении срока карантина) и на 40-е сутки [18]. Кишечная микробиота оценивалась методом бактериологического посева по стандартным методикам. В качестве объектов микробиологического исследования были выбраны Bifidobacterium spp., Lactobacterium spp., Escherichia coli.

Изучение активности изофермента CYP3A4 производили с использованием в качестве маркерной субстанции ивабрадина, вводимого крысам при помощи интрагастрального зонда (5 мг/кг) на 40-е сутки эксперимента. После введения ивабрадина животных помещали на 6 ч. в метаболические камеры для сбора мочи. Активность CYP3A4 оценивали путем определения метаболического соотношения N-десметиливабрадин/ивабрадин в моче [19; 20] при помощи хроматографической системы высокого давления Agilent 1260 и гибридной масс-спектрометрической системы Sciex QTRAP 5500 на базе тандемного масс-анализатора типа тройной квадруполь.

Статистическая обработка полученных результатов производилась с помощью программ MS Excel (Microsoft, США), GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., США). Параметры распределения оценивали по критериям Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка; сравнение групп производили при помощи t-критерия Стьюдента (при нормальном распределении) и U-критерия Манна-Уитни (распределение, отличающееся от нормального). Корреляционный анализ проводили с использованием рангового критерия Спирмена.

Результаты исследования и их обсуждение

В ходе исследования обнаружены дисбиотические нарушения в составе кишечной микробиоты у крыс, подвергнутых хронической алкогольной интоксикации, сопровождающиеся снижением количества представителей пробиотических штаммов.

Анализ результатов микробиологического исследования у животных экспериментальной группы выявил сокращение сахаролитических бактерий – Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. на 2–4 порядка (рис. 1).

 

Рисунок 1 - Состояние сахаролитической микробиоты кишечника крыс после алкоголизации.

Примечание: ** – p<0,01 (U-критерий Манна-Уитни)

 

Изменения в составе микробиоты сопровождались статистически значимым увеличением метаболического отношения N-десметиливабрадин/ивабрадин в моче крыс и достоверным снижением общей экскреции данных соединений (p<0,001; см. рис. 2). Повышение метаболического отношения может быть связано с индуцирующим действием алкоголя на различные ферментативные системы организма, включающие цитоплазменные оксидаз, микросомальные оксигеназы и ряд изоферментов системы цитохрома P450, в том числе и CYP3A4, субстратом которого является ивабрадин. В то же время, наблюдаемое снижение общей экскреции ивабрадина и его метаболита свидетельствует о снижении скорости всасывания ивабрадина в желудочно-кишечном тракте.

 

Рисунок 2 - Метаболическое соотношение N-десметиливабрадин/ивабрадин и их общая экскреция.

Примечание: *** – p<0,05 (t-критерий Стьюдента)

 

Показатели, характеризующие метаболизм ивабрадина, и состояние микробиоты кишечника крыс коррелировали между собой (см. рис. 3): метаболическое отношение находилось в обратной, а общая экскреция – в прямой корреляционной взаимосвязи с содержанием бифидо- и лактобактерий, что указывает на возможное влияние микробиоты на фармакокинетические показатели ивабрадина. Таким образом, экспериментальная алкоголизация оказала значительное влияние на состояние кишечной микробиоты и, как возможное следствие, на метаболизм ивабрадина – субстрата CYP3A4, что может требовать в клинической ситуации более пристального внимания врача к назначаемым препаратам. Однако для оценки клинической значимости подобных взаимодействий необходимы дальнейшие исследования.

 

Рисунок 3 - Корреляция показателей метаболизма ивабрадина и состоянием сахаролитической микробиоты. Примечание: показаны коэффициенты корреляции и уровень значимости по ранговому критерию Спирмена, сплошная линия – результаты линейной регрессии для лактобактерий, пунктирная – для бифидобактерий

 

Заключение

В ходе работы было обнаружено, что хроническая алкогольная интоксикация в эксперименте сопровождается сокращением количества представителей пробиотических штаммов (бифидобактерии, лактобактерии). При использовании ивабрадина в качестве маркерного субстрата для фенотипирования активности CYP3A4 в группе животных, подвергнутых алкоголизации, было обнаружено увеличение метаболического отношения и снижение общей экскреции ивабрадина и его метаболита с мочой, коррелировавшие с содержанием лактобактерий и биофидобактерий. Обнаруженные изменения указывают на участие кишечной микробиоты в метаболизме ивабрадина и, возможно, иных лекарственных веществ – субстратов CYP3A4, вводимых энтеральным путем.

×

About the authors

Boris Evgenyevich Tolkachev

Volgograd State Medical University

Author for correspondence.
Email: boris.volgmed@mail.ru

candidate of medical sciences, associate professor of Fundamental Medicine and Biology Department

Russian Federation, Volgograd

Evgeny Igorevich Morkovin

Volgograd State Medical University; Volgograd Medical Research Center

Email: e.i.morkovin@gmail.com

candidate of medical sciences, associate professor of Fundamental Medicine and Biology Department; senior researcher of Genomic and Proteomic Researches Laboratory

Russian Federation, Volgograd; Volgograd

Liliya Petrovna Knyshova

Volgograd State Medical University; Volgograd Medical Research Center

Email: knyshova-liliya@inbox.ru

postgraduate student of Clinical Laboratory Diagnostics Department; junior researcher of Genomic and Proteomic Researches Laboratory

Russian Federation, Volgograd; Volgograd

Anatoly Trofimovich Yakovlev

Volgograd State Medical University

Email: yakov1609@yandex.ru

doctor of medical sciences, professor, head of Clinical Laboratory Diagnostics Department

Russian Federation, Volgograd

Andrey Valeryevich Strygin

Volgograd State Medical University; Volgograd Medical Research Center

Email: drumsav@mail.ru

candidate of medical sciences, head of Fundamental Medicine and Biology Department; head of Genomic and Proteomic Researches Laboratory

Russian Federation, Volgograd; Volgograd

References

  1. Rolfe R.D. Interactions among microorganisms of the indigenous intestinal flora and their influence on the host // Rev Infect Dis. 1984. Vol. 6. Suppl 1. S. 73-79.
  2. Goodacre R. Metabolomics of a superorganism // J. Nutr 2007. Vol. 137 (1 Suppl). P. 259-266.
  3. Turnbaugh P.J., Ley R.E., Hamady M. et al. The human microbiome project // Nature. 2007. Vol. 449 (7164). P. 804-810.
  4. Пауков B.C., Угрюмов А.И., Беляева Н.Ю. Межорганные отношения при алкогольной интоксикации // Архив патологии. 1991. Т. 53, № 3. С. 3-10.
  5. Jenkins D.J.A., Kendall C.W.C., Vuksan V. Inulin, Oligofructose and Intestinal Function // J. Nutr. 1999. Vol. 129. P. 1431-1433.
  6. Тюренков И.Н., Куркин Д.В., Волотова Е.В., Бакулин Д.А. Роль микрофлоры кишечника, состава пищи, GPR41 и GPR43 рецепторов к короткоцепочечным жирным кислотам в энергетическом обмене позвоночных животных // Успехи физиологических наук. 2017. Т. 48, № 2. С. 141-153.
  7. Хавкин А.И. Микрофлора пищеварительного тракта. М.: Фонд социальной педиатрии, 2006. 416 с.
  8. Кнышова Л.П., Яковлев А.Т., Морковин Е.И., Доценко А.М. Динамика микробиологических показателей и провоспалительных интерлейкинов при моделировании хронической алкогольной интоксикации у крыс // Врач-аспирант. 2017. Т. 84, № 5. С. 69-75.
  9. Кнышова Л.П., Яковлев А.Т. Роль эндогенной интоксикации в нарушении гомеостаза организма человека при алкогольной интоксикации // Наука в современном информационном обществе: мат-лы IX междунар. науч.-практ. конф. М.: НИЦ «Академический», 2016. С. 31-33.
  10. Кнышова Л.П., Яковлев А.Т., Ларионов С.С. Экзо- и эндогенные этиологические факторы нарушения микробиоценоза // Современные инновации. 2016. № 5 (7). С. 53-57.
  11. Bode Ch., Schäfer C., Bode J.Ch. The role of gut-derived bacterial toxins (endotoxin) for the development of alcoholic liver disease in man // Gut and the Liver. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Boston, London. 1998. P. 281-298.
  12. Paiva S.A.R., Sepe T.E., Booth S.L., Camilo M.E., O'Brien M.E., Davidson K.W., Sadowski J.A., Russell R.M. Interaction between vitamin K nutriture and bacterial overgrowth in hypochlorhydria induced by omeprazole // Am. J. Clin. Nutr. 1998. Vol. 68. P. 699-704.
  13. Gill S.R., Pop М., DeBoy R.T. et al. Metagenomic Analysis of the Human Distal Gut Microbiome // Science. 2 June 2006. Vol. 312. P. 1355-1359.
  14. Куценко С.А. Основы токсикологии. М.: Фолиант, 2004. 570 с.
  15. Черняк Ю.И., Колесников С.И., Черняк Е.В. Цитохром Р450: основные представления, методы исследования, значение для практической медицины: учеб.-метод. пособие. 2-е изд., испр. Иркутск: Изд-во ИГУ, 2014. С. 47.
  16. Кнышова Л.П., Поройский С.В., Яковлев А.Т., Морковин Е.И., Тарасов А.С. Критерии достоверности воспроизведения экспериментальной модели хронической алкогольной интоксикации // Волгоградский научно-медицинский журнал. 2016. № 4 (52). С. 48-52.
  17. Кнышова Л.П., Поройский С.В., Яковлев А.Т., Морковин Е.И. Влияние экспериментальной хронической эндогенной алкогольной интоксикации на микрофлору кишечника // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. 2016. № 4 (60). С. 40-44.
  18. Даштемирова Д.Х., Яковлев А.Т., Кнышова Л.П. Влияние хронической алкогольной интоксикации на состояние микрофлоры кишечника в эксперименте // Современные тенденции в науке и образовании: сб. материалов XVIII междунар. науч.-практ. конф. 2017. С. 303-304.
  19. Петров В.И., Магницкая О.В., Толкачев Б.Е. и др. Определение метаболического отношения N-деметиливабрадин/ивабрадин для оценки активности CYP3A4 // Вестник ВолгГМУ. 2013. № 3 (47). С. 30-32.
  20. Петров В.И., Магницкая О.В., Толкачев Б.Е. и др. Сравнительная оценка методов определения метаболического коэффициента N-деметиливабрадин/ ивабрадин в плазме и моче // Вестник ВолгГМУ. 2013. № 3 (47). С. 33-34.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Figure 1 - The state of the saccharolytic microbiota of the intestine of rats after alcoholization. Note: ** - p <0.01 (Mann-Whitney U-test)

Download (29KB)
Indexing metadata
3. Figure 2 - Metabolic ratio of N-desmethylivabradine / ivabradine and their total excretion. Note: *** - p <0.05 (Student's t-test)

Download (26KB)
Indexing metadata
4. Figure 3 - Correlation of indices of ivabradine metabolism and the state of the saccharolytic microbiota. Note: the correlation coefficients and the level of significance according to the Spearman rank test are shown, the solid line is the results of linear regression for lactobacilli, the dotted line is for bifidobacteria.

Download (32KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2017 Tolkachev B.E., Morkovin E.I., Knyshova L.P., Yakovlev A.T., Strygin A.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies