Evaluation of regeneration capacity of Rhododendron luteum Sweet in in vitro culture

Full Text

Введение

В России и странах ближнего зарубежья разные виды рододендронов привлечены в культуру со второй половины XVIII века [1; 2], и в настоящее время растения широко используются в садово-парковом строительстве, селекции.

Rhododendron luteum Sweet (рододендрон желтый) – листопадный кустарник семейства Ericaceae (вересковые) – получил широкое распространение в Европе и Северной Америке благодаря высоким декоративным качествам [3; 4]. Родина Rh. luteum – Кавказ, Западная Европа, Малая Азия [1; 3; 5]. Растение очень декоративно в период массового цветения и осенью благодаря яркой окраске листьев. Цветки диаметром до 6 см собраны по 7–12 шт. в щитковидные соцветия. Цветение начинается одновременно с распусканием листьев и характеризуется длительным и волнообразным периодом. В естественных условиях произрастания рододендроны размножаются, главным образом, семенным путем. Интродукционные исследования показали высокую зимостойкость и декоративность сортов и гибридов Rh. luteum в Центральном регионе, на Урале и в Сибири [6]. Размножение рододендронов процесс трудоемкий и представляет определенные сложности. Традиционно размножают Rh. luteum семенами, зелеными черенками и делением куста. При семенном размножении растения достигают генеративного онтогенетического состояния только на четвертый или пятый год жизни. Черенкование и укоренение листопадных рододендронов проводится в очень сжатые сроки весной в период, когда появляется прирост текущего года [7]. При использовании зеленых черенков даже с обработкой стимуляторами корнеобразования наблюдается низкий процент укоренения (до 20%). Также и при размножении рододендронов делением куста отмечен низкий коэффициент размножения [1; 5; 8; 9].

В Ботанический сад Института биологии Коми НЦ УрО РАН Rh. luteum привлечен пятилетними саженцами в 2008 г. из г. Йошкар-Олы, Ботанического сада-института ПГТУ. В настоящее время в коллекции в удовлетворительном состоянии сохраняются несколько растений данного вида. В условиях подзоны средней тайги Республики Коми растения Rh. luteum растут медленно. Так, в 2009 г. высота растений составила 25 см, в 2011 г. – 28 см, в 2013 г. – 45 см, в 2016 г. – 60 см. Линейный рост побегов в эти годы составлял 8–24 см. Кустарники сформировали компактную и разветвленную крону. Начало вегетации Rh. luteum приурочено к третьей декаде мая. Первое цветение растений в 2011 г. (8–16 июня) из-за повреждения цветочных почек было слабым. Более интенсивное цветение наблюдалось в конце мая в 2013, 2014 и 2016 гг. (рис. 1).

 

Рисунок 1 – Цветение Rhododendron luteum

 

Цветки диаметром 3,8–4,0 см собраны в плотные соцветия по 16–20 шт. и располагаются на концах всех побегов. Плодоношение впервые отмечалось в 2016 г., в соцветиях завязалось по 2–3 плода. Окончание роста побегов происходит в конце июля – начале августа. В это же время закладываются генеративные почки [10].

В условиях подзоны средней тайги Республики Коми размножение Rh. luteum и семенным, и вегетативным путем затруднено из-за редкого получения фертильных семян и незначительного прироста побегов. Однако благодаря своим высоким декоративным качествам в сочетании с достаточной неприхотливостью к условиям выращивания Rh. luteum является весьма перспективным для продолжения разработки способов его репродукции в условиях Севера. Поэтому целесообразно было оценить регенерационную способность Rh. luteum в культуре in vitro. Разработкой биотехнологических приемов культивирования растений данного вида и созданием протоколов, необходимых для устойчивого воспроизводства растений, для северных условий не проводилось.

Первые сведения о возможности использования методов in vitro для видов рода Rhododendron были даны Андерсоном [11], который разработал питательную среду для их выращивания. Также учеными в разных странах рассматривались частные вопросы по выбору эксплантов, способам стерилизации, подбору физиологически активных веществ, модификации питательных сред для разных этапов микроклонального размножения и различных эксплантов [12–15]. Показано, что лучшими эксплантами Rh. luteum являются части ювенильных растений и черенки с побегов текущего года [9]. Повышенный интерес вызывал подбор питательных сред на разных этапах микроклонального размножения Rh. luteum [12], так как каждый из них в размножении рододендронов представляет определенные трудности. Известно несколько модификаций питательных сред. Классической питательной средой, используемой для пролиферации побегов видов рода Rhododendron, является среда по прописи Андерсона, дополненная 15 мг/л 2 IP и 4 мг/л ИУК [16], коэффициент размножения составляет 5 шт. на побег при их средней высоте 1,5 см [15]. Вторая среда, используемая для размножения Rh. luteum, – WPM, дополненная 15 мг/л 2 IP и 4 мг/л ИУК, в которой коэффициент размножения составляет 4,5 шт. на эксплант при высоте побегов 3,3 см [15]. К недостаткам данных сред следует отнести высокие дозы фитогормонов, при длительном использовании вызывающие витрификацию побегов. Введение в питательную среду высокой концентрации 2 IP было оправдано, так как побеги рододендронов обладают слабой способностью к ветвлению, и только высокие дозы 2 IP стимулируют морфогенез и увеличивают коэффициент мультипликации побегов.

Анализ литературных данных показал, что в настоящее время на этапе собственно размножения используют в качестве регуляторов роста разные фитогормоны цитокининового ряда 2ІР, кинетин, зеатин, 6-БАП, в различных концентрациях (1,0–1,5 мг/л) и в сочетании с ауксинами, в частности с ИУК в концентрации 1,0 мг/л [16–18]. В последние годы предложен для использования в культуре in vitro новый синтетический фитогормон тидиазурон, обладающий одновременно ауксиновым и цитокининовым действиями [19], который в концентрации 0,5–10 мкм достоверно повышает коэффициент размножения древесных растений, и в частности представителей рода Rhododendron [13; 20]. Отрицательной стороной высокой эффективности тидиазурона является развитие нежелательных аномалий побегов древесных растений (гипергидричность, фасциация, укороченность и утолщенность побегов), что выражается в слабом удлинении, и укоренении побегов [21]. Для преодоления вызванных тидиазуроном нарушений в культуре in vitro предложено снижение его концентрации до 0,01–1,0 мкм [20] или использование двухэтапной процедуры регенерации – индукция побегов при помощи тидиазурона с последующим культивированием на безгормональной среде [22; 23]. Некоторые исследователи добавляют ауксины, чтобы преодолеть чрезмерный эффект цитокининов и получить микропобеги хорошего качества [24]. Высокие концентрации тидиазурона способствуют пролиферативной активности клеток, низкие – вытягиванию побегов [25].

Представители рода Rhododendron имеют генотипические различия, поэтому протоколы как для вечнозеленых сортов, так и для листопадных сортовых и дикорастущих представителей рода должны подбираться экспериментально [24].

Целью нашей работы являлось выявление оптимальных условий (состава питательной среды и соотношения фитогормонов) на этапе собственно размножения в культуре in vitro высокодекоративного вида Rhododendron luteum и оценка его регенерационного потенциала.

Объекты и методика исследований

Семена Rh. luteum (название вида уточнялось по: The World Flora Online [26]) были собраны в Ботаническом саду Института биологии Коми НЦ УрО РАН 12.10.2022 г. Все работы с асептической культурой проводили согласно рекомендациям, предложенным Н.В. Катаевой [27] и Ф.Л. Калининым [28] с соавторами.

Семена вводили в культуру in vitro 30.11.2022 г. и 14.12.2022 г. по 20 шт. семян в двух повторностях и в двух вариантах опыта. Стерилизацию семян проводили в два этапа. В асептических условиях выдерживали в мыльном растворе 20 минут, затем в доместосе (10%) – 10 мин. и далее в ламинарном боксе в этиловом спирте (70%) – 1 минуту и в диациде (0,1%) – 5 минут. При такой схеме стерилизации получили 100% стерильные семена, которые ввели на среду WPM без гормонов. Массовое прорастание семян наблюдалось на 14 сутки культивирования. Всхожесть семян составила 72%. Продолжительность одного пассажа – 60 суток. К концу первого пассажа высота побегов достигала 1 см. Побег делили на 2 части и, удаляя корешок, вводили на новую питательную среду по прописи Андерсона с добавлением тидиазурона (1 мг/л) и ИУК (1 мл/л). Следующие 5 пассажей проводились на такой же питательной среде (табл. 1). Начиная с 6 пассажа, для работы на этапе собственно размножения, мы использовали две модифицированные питательные среды. Первая – по прописи Андерсона, предложенная А.А. Мухаметвафиной [9], которая представляет собой сниженные в два раза концентрации макросолей и микросолей. Вторая – среда Woody plant medium (WPM), предложенная И.В. Гафицкой с соавторами [29; 30], в которой калийная соль азотной кислоты заменена на калийную соль серной кислоты и дигидрофосфат натрия заменен на нитрат кальция (табл. 2). pH среды доводили до 4,8–5,0 при помощи 0,1 Н КОН, до автоклавирования.

 

Таблица 1 – Влияние числа пассажей на коэффициент размножения и морфогенез Rh. luteum на среде Андерсона + ТИД 1 + ИУК 1

Номер пассажа	Продолжительность пассажа, сут.	Коэффициент размножения (число частей конгломерата, полученного с одного экспланта), шт.	Высота побега, см	Морфогенез, %
Введение в культуру in vitro (WPM без гормонов)	60	–	1,0	–
1 пассаж	60	–	0,7	83
2 пассаж	60	4	0,7	100
3 пассаж	60	4	0,5	100
4 пассаж	50	10	0,5	100
5 пассаж	40	10	0,5	100
6 пассаж	40	10	0,5	100

 

Таблица 2 – Модифицированные питательные среды на этапе собственно размножения Rh. luteum

Состав питательной среды	Среда 1 [9]. Модифицированная среда Андерсона, мг/л	Среда 2 [29]. Модифицированная среда WPM, мг/л
NH4NO3	200	400
KNO3	240	–
MgSO4 · 7H2O	185	181
NaH2PO4 · H2O	190	–
FeSO4 · 7H2O	27,8	27,8
NaЭДТА · 2H2O	37,2	37,2
CaCl2 · 2H2O	220	72,5
Ca(NO3)2 · 4H2O	–	386
K2SO4	–	990
Na2MoO4 · 2H2O	0,125	0,25
MnSO4 · H2O	8,45	22,3
ZnSO4 · 7H2O	4,3	8,6
KI	–	0,75
H3BO3	3,1	6,2
CuSO4 · 5H2O	0,01	0,25
Сульфат аденин	80	–
Глицин	–	2
Сахароза	15	20
Пиридоксин	–	0,5
Агар	8	4

 

Результаты исследований и их обсуждение

Как известно, одной из важных составляющих при клональном микроразмножении древесных растений является длительность и число пассажей. Продолжительность и число пассажей способны значительно влиять на пролиферацию и темпы развития культуры на этапе собственно размножения в культуре in vitro. При длительных пассажах происходит усыхание среды, остановка роста и развития побегов. Многочисленные субкультивирования провоцируют накопление мутаций, происходит старение эксплантов и снижается скорость линейного роста и мультипликация побегов. В таблице 1 показано, что при первом пассаже морфогенез достигал 83%, а пролиферация побегов Rh. luteum происходила медленно с длительностью одного пассажа 60 суток, в последующих субкультивированиях морфогенез достигал 100%.

Повышение морфогенетической активности отмечено со второго пассажа и сохраняется до 6 пассажа. В этот период происходит активная пролиферация за счет снятия апикального доминирования и развития пазушных почек. Высокие темпы роста и развития побегов наблюдаются на 4–6 пассажах, где происходит сокращение продолжительности субкультивирования до 40–50 дней. Конгломерат, состоящий из почек и микропобегов высотой 0,2–0,7 см, увеличивался в объеме и имел вид шара. Элонгация побегов не происходила. В этих пассажах достигается наибольший коэффициент мультипликации побегов (10 конгломератов на один эксплант) и сохраняется высокая морфогенетическая реакция. В среднем за 5 месяцев активной работы с культурой на этапе мультипликации в сочетании с активным черенкованием можно получить до 40 конгломератов на эксплант.

После 6-го пассажа часть конгломератов была введена на питательную среду по прописи Андерсона без гормонов с целью выявления морфологических изменений, так как присутствие в среде тидиазурона (рис. 2: А), как отмечают некоторые исследователи, может вызывать витрификацию и другие нарушения в развитии побегов. В наших опытах конгломераты побегов хорошо развивались, имели нормальную окраску, и морфологические изменения не наблюдались (рис. 2: Б).

 

Рисунок 2 – Микропобеги на среде Андерсона: А – среда с ТИД 1 + ИУК 1 мг/л (30-е сут.), Б – среда без гормонов (40-е сут., 4–6 пассажи)

 

По данным литературы для микроклонального размножения разных видов рододендрона используют среды с различным составом и концентрацией макро- и микросолей, физиологически активных веществ, а также органических соединений и витаминов [31; 9]. В данной работе на этапе собственно размножения для одновременного получения пролиферации и элонгации побегов использовали фитогормоны тидиазурон, БАП и ИУК в различных концентрациях и комбинациях (табл. 2).

Для выявления влияния разных питательных сред на мультипликацию и рост микропобегов Rh. luteum использовали две модифицированные среды по прописи Андерсона и WPM. В табл. 3 показано влияние состава питательной среды и фитогормонов на регенерацию и элонгацию микропобегов на 40 сутки культивирования. Исследования по мультипликации микропобегов на этапе собственно размножения показали, что обе модифицированные среды подходят для этапа собственно микроразмножения.

 

Таблица 3 – Влияние питательной среды, состава и концентраций фитогормонов, коэффициент размножения Rh. luteum, 6 пассаж (40-е сутки культивирования)

Фитогормоны, мг/л	Среда 1 [9]. Модифицированная среда Андерсона, мг/л		Среда 2 [29]. Модифицированная среда WPM, мг/л
	Высота побегов, см	Коэффициент размножения, шт.	Высота побегов, см	Коэффициент размножения, шт.
БАП 0,5 + ИУК 0,5	1,2a	10,3a	1,2a	5,4a
ТИД 1 + ИУК 2	0,5b	9,5ab	0,5b	–
ИУК 2	0,8c	2,9c	1,7c	5,0b
ТИД 1 + ИУК 1	0,3bd	–	0,8d	3,9ac

Примечание. Подсчет не проводился (ввиду очень сближенных междоузлий). ^a, ^b, ^c, ^d – показатели значимости различий при тесте Дункана (P = 0,05), где разные буквы за средним значением в столбцах показывают, что различия значимы, одинаковые буквы – различий нет.

 

При введении в различные питательные среды фитогормоны по-разному проявляют свою активность. Совместное использование тидиазурона (1 мг/л) и ИУК в концентрациях (1 и 2 мг/л) на модифицированной среде Андерсона оказывало ингибирующее влияние на элонгацию побегов Rh. luteum, но стимулирующее – для пролиферации почек, что способствовало развитию побегов (рис. 3: А, Б). На модифицированной среде WPM увеличение концентрации ИУК в два раза в присутствии тидиазурона (1 мг/л) значимо не повлияло на элонгацию побегов, однако усилило регенеративную способность эксплантов, и коэффициент размножения составил 9,5 побегов на эксплант, при этом наблюдались небольшие аномалии в морфологии листьев, которые были преодолены при помощи переноса на безгормональную питательную среду Андерсона (рис. 4, 5). Высота побегов оказалась существенно ниже и составила 0,3–0,8 см на обеих средах. Значительно усилил элонгацию побегов Rh. luteum ИУК 2 мг/л на среде WPM (рис. 6). В присутствии в обеих питательных средах БАП 0,5 мл/л и ИУК 0,5 мл/л было получено максимальное число микропобегов (высотой более 1 см), однако на среде 2 коэффициент размножения был в два раза ниже (рис. 7).

 

Рисунок 3 – Конгломераты на среде Андерсона: А – среда с ТИД 1 + ИУК 1, Б – среда с ТИД 1 + ИУК 2

 

Рисунок 4 – Среда WPM + ТИД 1 + ИУК 2

 

Рисунок 5 – Среда Андерсона без гормонов

 

Рисунок 6 – Среда WPM + ИУК 2

 

Рисунок 7 – Среда WPM + БАП 0,5 + ИУК 0,5

 

Заключение

Таким образом, показано, что на этапе собственно микроразмножения Rhododendron luteum под действием тидиазурона в течение 6 пассажей наблюдается активная пролиферация почек и регенерация побегов, тип органогенеза не изменяется – активация меристем. Элонгация побегов достигается на безгормональной среде Андерсона. Изучение влияния двух модифицированных питательных сред (Андерсона и WPM) на морфогенез показало, что обе питательные среды положительно влияют на темпы роста и развития побегов. Наибольший коэффициент размножения получен на модифицированной среде Андерсона в присутствии БАП 0,5 + ИУК 0,5 мг/л на последействии тидиазурона.

About the authors

Zhanna Eduardovna Mikhovich

Institute of Biology of Komi Scientific Centre of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: mihovich@ib.komisc.ru

Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher of the Botanical Garden

Russian Federation, Syktyvkar

Olga Valeryevna Skrotskaya

Institute of Biology of Komi Scientific Centre of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: skrockaja@ib.komisc.ru

Candidate of Biological Sciences, Head of the Botanical Garden

Russian Federation, Syktyvkar

Anna Nikolaevna Smirnova

Institute of Biology of Komi Scientific Centre of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: smirnova@ib.komisc.ru

Junior Researcher of the Botanical Garden

Russian Federation, Syktyvkar

References

Supplementary files