Оценка регенерационной способности Rhododendron luteum Sweet в культуре in vitro

Полный текст

Введение

В России и странах ближнего зарубежья разные виды рододендронов привлечены в культуру со второй половины XVIII века [1; 2], и в настоящее время растения широко используются в садово-парковом строительстве, селекции.

Rhododendron luteum Sweet (рододендрон желтый) – листопадный кустарник семейства Ericaceae (вересковые) – получил широкое распространение в Европе и Северной Америке благодаря высоким декоративным качествам [3; 4]. Родина Rh. luteum – Кавказ, Западная Европа, Малая Азия [1; 3; 5]. Растение очень декоративно в период массового цветения и осенью благодаря яркой окраске листьев. Цветки диаметром до 6 см собраны по 7–12 шт. в щитковидные соцветия. Цветение начинается одновременно с распусканием листьев и характеризуется длительным и волнообразным периодом. В естественных условиях произрастания рододендроны размножаются, главным образом, семенным путем. Интродукционные исследования показали высокую зимостойкость и декоративность сортов и гибридов Rh. luteum в Центральном регионе, на Урале и в Сибири [6]. Размножение рододендронов процесс трудоемкий и представляет определенные сложности. Традиционно размножают Rh. luteum семенами, зелеными черенками и делением куста. При семенном размножении растения достигают генеративного онтогенетического состояния только на четвертый или пятый год жизни. Черенкование и укоренение листопадных рододендронов проводится в очень сжатые сроки весной в период, когда появляется прирост текущего года [7]. При использовании зеленых черенков даже с обработкой стимуляторами корнеобразования наблюдается низкий процент укоренения (до 20%). Также и при размножении рододендронов делением куста отмечен низкий коэффициент размножения [1; 5; 8; 9].

В Ботанический сад Института биологии Коми НЦ УрО РАН Rh. luteum привлечен пятилетними саженцами в 2008 г. из г. Йошкар-Олы, Ботанического сада-института ПГТУ. В настоящее время в коллекции в удовлетворительном состоянии сохраняются несколько растений данного вида. В условиях подзоны средней тайги Республики Коми растения Rh. luteum растут медленно. Так, в 2009 г. высота растений составила 25 см, в 2011 г. – 28 см, в 2013 г. – 45 см, в 2016 г. – 60 см. Линейный рост побегов в эти годы составлял 8–24 см. Кустарники сформировали компактную и разветвленную крону. Начало вегетации Rh. luteum приурочено к третьей декаде мая. Первое цветение растений в 2011 г. (8–16 июня) из-за повреждения цветочных почек было слабым. Более интенсивное цветение наблюдалось в конце мая в 2013, 2014 и 2016 гг. (рис. 1).

 

Рисунок 1 – Цветение Rhododendron luteum

 

Цветки диаметром 3,8–4,0 см собраны в плотные соцветия по 16–20 шт. и располагаются на концах всех побегов. Плодоношение впервые отмечалось в 2016 г., в соцветиях завязалось по 2–3 плода. Окончание роста побегов происходит в конце июля – начале августа. В это же время закладываются генеративные почки [10].

В условиях подзоны средней тайги Республики Коми размножение Rh. luteum и семенным, и вегетативным путем затруднено из-за редкого получения фертильных семян и незначительного прироста побегов. Однако благодаря своим высоким декоративным качествам в сочетании с достаточной неприхотливостью к условиям выращивания Rh. luteum является весьма перспективным для продолжения разработки способов его репродукции в условиях Севера. Поэтому целесообразно было оценить регенерационную способность Rh. luteum в культуре in vitro. Разработкой биотехнологических приемов культивирования растений данного вида и созданием протоколов, необходимых для устойчивого воспроизводства растений, для северных условий не проводилось.

Первые сведения о возможности использования методов in vitro для видов рода Rhododendron были даны Андерсоном [11], который разработал питательную среду для их выращивания. Также учеными в разных странах рассматривались частные вопросы по выбору эксплантов, способам стерилизации, подбору физиологически активных веществ, модификации питательных сред для разных этапов микроклонального размножения и различных эксплантов [12–15]. Показано, что лучшими эксплантами Rh. luteum являются части ювенильных растений и черенки с побегов текущего года [9]. Повышенный интерес вызывал подбор питательных сред на разных этапах микроклонального размножения Rh. luteum [12], так как каждый из них в размножении рододендронов представляет определенные трудности. Известно несколько модификаций питательных сред. Классической питательной средой, используемой для пролиферации побегов видов рода Rhododendron, является среда по прописи Андерсона, дополненная 15 мг/л 2 IP и 4 мг/л ИУК [16], коэффициент размножения составляет 5 шт. на побег при их средней высоте 1,5 см [15]. Вторая среда, используемая для размножения Rh. luteum, – WPM, дополненная 15 мг/л 2 IP и 4 мг/л ИУК, в которой коэффициент размножения составляет 4,5 шт. на эксплант при высоте побегов 3,3 см [15]. К недостаткам данных сред следует отнести высокие дозы фитогормонов, при длительном использовании вызывающие витрификацию побегов. Введение в питательную среду высокой концентрации 2 IP было оправдано, так как побеги рододендронов обладают слабой способностью к ветвлению, и только высокие дозы 2 IP стимулируют морфогенез и увеличивают коэффициент мультипликации побегов.

Анализ литературных данных показал, что в настоящее время на этапе собственно размножения используют в качестве регуляторов роста разные фитогормоны цитокининового ряда 2ІР, кинетин, зеатин, 6-БАП, в различных концентрациях (1,0–1,5 мг/л) и в сочетании с ауксинами, в частности с ИУК в концентрации 1,0 мг/л [16–18]. В последние годы предложен для использования в культуре in vitro новый синтетический фитогормон тидиазурон, обладающий одновременно ауксиновым и цитокининовым действиями [19], который в концентрации 0,5–10 мкм достоверно повышает коэффициент размножения древесных растений, и в частности представителей рода Rhododendron [13; 20]. Отрицательной стороной высокой эффективности тидиазурона является развитие нежелательных аномалий побегов древесных растений (гипергидричность, фасциация, укороченность и утолщенность побегов), что выражается в слабом удлинении, и укоренении побегов [21]. Для преодоления вызванных тидиазуроном нарушений в культуре in vitro предложено снижение его концентрации до 0,01–1,0 мкм [20] или использование двухэтапной процедуры регенерации – индукция побегов при помощи тидиазурона с последующим культивированием на безгормональной среде [22; 23]. Некоторые исследователи добавляют ауксины, чтобы преодолеть чрезмерный эффект цитокининов и получить микропобеги хорошего качества [24]. Высокие концентрации тидиазурона способствуют пролиферативной активности клеток, низкие – вытягиванию побегов [25].

Представители рода Rhododendron имеют генотипические различия, поэтому протоколы как для вечнозеленых сортов, так и для листопадных сортовых и дикорастущих представителей рода должны подбираться экспериментально [24].

Целью нашей работы являлось выявление оптимальных условий (состава питательной среды и соотношения фитогормонов) на этапе собственно размножения в культуре in vitro высокодекоративного вида Rhododendron luteum и оценка его регенерационного потенциала.

Объекты и методика исследований

Семена Rh. luteum (название вида уточнялось по: The World Flora Online [26]) были собраны в Ботаническом саду Института биологии Коми НЦ УрО РАН 12.10.2022 г. Все работы с асептической культурой проводили согласно рекомендациям, предложенным Н.В. Катаевой [27] и Ф.Л. Калининым [28] с соавторами.

Семена вводили в культуру in vitro 30.11.2022 г. и 14.12.2022 г. по 20 шт. семян в двух повторностях и в двух вариантах опыта. Стерилизацию семян проводили в два этапа. В асептических условиях выдерживали в мыльном растворе 20 минут, затем в доместосе (10%) – 10 мин. и далее в ламинарном боксе в этиловом спирте (70%) – 1 минуту и в диациде (0,1%) – 5 минут. При такой схеме стерилизации получили 100% стерильные семена, которые ввели на среду WPM без гормонов. Массовое прорастание семян наблюдалось на 14 сутки культивирования. Всхожесть семян составила 72%. Продолжительность одного пассажа – 60 суток. К концу первого пассажа высота побегов достигала 1 см. Побег делили на 2 части и, удаляя корешок, вводили на новую питательную среду по прописи Андерсона с добавлением тидиазурона (1 мг/л) и ИУК (1 мл/л). Следующие 5 пассажей проводились на такой же питательной среде (табл. 1). Начиная с 6 пассажа, для работы на этапе собственно размножения, мы использовали две модифицированные питательные среды. Первая – по прописи Андерсона, предложенная А.А. Мухаметвафиной [9], которая представляет собой сниженные в два раза концентрации макросолей и микросолей. Вторая – среда Woody plant medium (WPM), предложенная И.В. Гафицкой с соавторами [29; 30], в которой калийная соль азотной кислоты заменена на калийную соль серной кислоты и дигидрофосфат натрия заменен на нитрат кальция (табл. 2). pH среды доводили до 4,8–5,0 при помощи 0,1 Н КОН, до автоклавирования.

 

Таблица 1 – Влияние числа пассажей на коэффициент размножения и морфогенез Rh. luteum на среде Андерсона + ТИД 1 + ИУК 1

Номер пассажа	Продолжительность пассажа, сут.	Коэффициент размножения (число частей конгломерата, полученного с одного экспланта), шт.	Высота побега, см	Морфогенез, %
Введение в культуру in vitro (WPM без гормонов)	60	–	1,0	–
1 пассаж	60	–	0,7	83
2 пассаж	60	4	0,7	100
3 пассаж	60	4	0,5	100
4 пассаж	50	10	0,5	100
5 пассаж	40	10	0,5	100
6 пассаж	40	10	0,5	100

 

Таблица 2 – Модифицированные питательные среды на этапе собственно размножения Rh. luteum

Состав питательной среды	Среда 1 [9]. Модифицированная среда Андерсона, мг/л	Среда 2 [29]. Модифицированная среда WPM, мг/л
NH4NO3	200	400
KNO3	240	–
MgSO4 · 7H2O	185	181
NaH2PO4 · H2O	190	–
FeSO4 · 7H2O	27,8	27,8
NaЭДТА · 2H2O	37,2	37,2
CaCl2 · 2H2O	220	72,5
Ca(NO3)2 · 4H2O	–	386
K2SO4	–	990
Na2MoO4 · 2H2O	0,125	0,25
MnSO4 · H2O	8,45	22,3
ZnSO4 · 7H2O	4,3	8,6
KI	–	0,75
H3BO3	3,1	6,2
CuSO4 · 5H2O	0,01	0,25
Сульфат аденин	80	–
Глицин	–	2
Сахароза	15	20
Пиридоксин	–	0,5
Агар	8	4

 

Результаты исследований и их обсуждение

Как известно, одной из важных составляющих при клональном микроразмножении древесных растений является длительность и число пассажей. Продолжительность и число пассажей способны значительно влиять на пролиферацию и темпы развития культуры на этапе собственно размножения в культуре in vitro. При длительных пассажах происходит усыхание среды, остановка роста и развития побегов. Многочисленные субкультивирования провоцируют накопление мутаций, происходит старение эксплантов и снижается скорость линейного роста и мультипликация побегов. В таблице 1 показано, что при первом пассаже морфогенез достигал 83%, а пролиферация побегов Rh. luteum происходила медленно с длительностью одного пассажа 60 суток, в последующих субкультивированиях морфогенез достигал 100%.

Повышение морфогенетической активности отмечено со второго пассажа и сохраняется до 6 пассажа. В этот период происходит активная пролиферация за счет снятия апикального доминирования и развития пазушных почек. Высокие темпы роста и развития побегов наблюдаются на 4–6 пассажах, где происходит сокращение продолжительности субкультивирования до 40–50 дней. Конгломерат, состоящий из почек и микропобегов высотой 0,2–0,7 см, увеличивался в объеме и имел вид шара. Элонгация побегов не происходила. В этих пассажах достигается наибольший коэффициент мультипликации побегов (10 конгломератов на один эксплант) и сохраняется высокая морфогенетическая реакция. В среднем за 5 месяцев активной работы с культурой на этапе мультипликации в сочетании с активным черенкованием можно получить до 40 конгломератов на эксплант.

После 6-го пассажа часть конгломератов была введена на питательную среду по прописи Андерсона без гормонов с целью выявления морфологических изменений, так как присутствие в среде тидиазурона (рис. 2: А), как отмечают некоторые исследователи, может вызывать витрификацию и другие нарушения в развитии побегов. В наших опытах конгломераты побегов хорошо развивались, имели нормальную окраску, и морфологические изменения не наблюдались (рис. 2: Б).

 

Рисунок 2 – Микропобеги на среде Андерсона: А – среда с ТИД 1 + ИУК 1 мг/л (30-е сут.), Б – среда без гормонов (40-е сут., 4–6 пассажи)

 

По данным литературы для микроклонального размножения разных видов рододендрона используют среды с различным составом и концентрацией макро- и микросолей, физиологически активных веществ, а также органических соединений и витаминов [31; 9]. В данной работе на этапе собственно размножения для одновременного получения пролиферации и элонгации побегов использовали фитогормоны тидиазурон, БАП и ИУК в различных концентрациях и комбинациях (табл. 2).

Для выявления влияния разных питательных сред на мультипликацию и рост микропобегов Rh. luteum использовали две модифицированные среды по прописи Андерсона и WPM. В табл. 3 показано влияние состава питательной среды и фитогормонов на регенерацию и элонгацию микропобегов на 40 сутки культивирования. Исследования по мультипликации микропобегов на этапе собственно размножения показали, что обе модифицированные среды подходят для этапа собственно микроразмножения.

 

Таблица 3 – Влияние питательной среды, состава и концентраций фитогормонов, коэффициент размножения Rh. luteum, 6 пассаж (40-е сутки культивирования)

Фитогормоны, мг/л	Среда 1 [9]. Модифицированная среда Андерсона, мг/л		Среда 2 [29]. Модифицированная среда WPM, мг/л
	Высота побегов, см	Коэффициент размножения, шт.	Высота побегов, см	Коэффициент размножения, шт.
БАП 0,5 + ИУК 0,5	1,2a	10,3a	1,2a	5,4a
ТИД 1 + ИУК 2	0,5b	9,5ab	0,5b	–
ИУК 2	0,8c	2,9c	1,7c	5,0b
ТИД 1 + ИУК 1	0,3bd	–	0,8d	3,9ac

Примечание. Подсчет не проводился (ввиду очень сближенных междоузлий). ^a, ^b, ^c, ^d – показатели значимости различий при тесте Дункана (P = 0,05), где разные буквы за средним значением в столбцах показывают, что различия значимы, одинаковые буквы – различий нет.

 

При введении в различные питательные среды фитогормоны по-разному проявляют свою активность. Совместное использование тидиазурона (1 мг/л) и ИУК в концентрациях (1 и 2 мг/л) на модифицированной среде Андерсона оказывало ингибирующее влияние на элонгацию побегов Rh. luteum, но стимулирующее – для пролиферации почек, что способствовало развитию побегов (рис. 3: А, Б). На модифицированной среде WPM увеличение концентрации ИУК в два раза в присутствии тидиазурона (1 мг/л) значимо не повлияло на элонгацию побегов, однако усилило регенеративную способность эксплантов, и коэффициент размножения составил 9,5 побегов на эксплант, при этом наблюдались небольшие аномалии в морфологии листьев, которые были преодолены при помощи переноса на безгормональную питательную среду Андерсона (рис. 4, 5). Высота побегов оказалась существенно ниже и составила 0,3–0,8 см на обеих средах. Значительно усилил элонгацию побегов Rh. luteum ИУК 2 мг/л на среде WPM (рис. 6). В присутствии в обеих питательных средах БАП 0,5 мл/л и ИУК 0,5 мл/л было получено максимальное число микропобегов (высотой более 1 см), однако на среде 2 коэффициент размножения был в два раза ниже (рис. 7).

 

Рисунок 3 – Конгломераты на среде Андерсона: А – среда с ТИД 1 + ИУК 1, Б – среда с ТИД 1 + ИУК 2

 

Рисунок 4 – Среда WPM + ТИД 1 + ИУК 2

 

Рисунок 5 – Среда Андерсона без гормонов

 

Рисунок 6 – Среда WPM + ИУК 2

 

Рисунок 7 – Среда WPM + БАП 0,5 + ИУК 0,5

 

Заключение

Таким образом, показано, что на этапе собственно микроразмножения Rhododendron luteum под действием тидиазурона в течение 6 пассажей наблюдается активная пролиферация почек и регенерация побегов, тип органогенеза не изменяется – активация меристем. Элонгация побегов достигается на безгормональной среде Андерсона. Изучение влияния двух модифицированных питательных сред (Андерсона и WPM) на морфогенез показало, что обе питательные среды положительно влияют на темпы роста и развития побегов. Наибольший коэффициент размножения получен на модифицированной среде Андерсона в присутствии БАП 0,5 + ИУК 0,5 мг/л на последействии тидиазурона.

Об авторах

Жанна Эдуардовна Михович

Институт биологии Коми научного центра УрО РАН

Email: mihovich@ib.komisc.ru

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела Ботанический сад

Россия, Сыктывкар

Ольга Валерьевна Скроцкая

Институт биологии Коми научного центра УрО РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: skrockaja@ib.komisc.ru

кандидат биологических наук, заведующий отделом Ботанический сад

Россия, Сыктывкар

Анна Николаевна Смирнова

Институт биологии Коми научного центра УрО РАН

Email: smirnova@ib.komisc.ru

младший научный сотрудник отдела Ботанический сад

Россия, Сыктывкар

Список литературы

Дополнительные файлы