Assessment of the quality of surface waters of a drinking reservoir using the method of biotesting on phytoplankton cells

Full Text

Введение

Оценка состояния водных объектов неразрывно сопряжена с изучением физико-химического состава проб воды с дальнейшим выявлением основных загрязнителей. Однако определение полного перечня загрязнителей весьма затруднительно по целому ряду причин. Одним из решений данной проблемы является использование методов биотестирования. Необходимость проведения оценки степени загрязнения окружающей среды по изменению состояния организма-индикатора отмечена в целом ряде работ [1–3]. В данном направлении наряду с поиском тест-объектов, обладающих специфической чувствительностью к отдельным загрязнителям, производится разработка методов биотестирования, обеспечивающих большую информативность о состоянии исследуемого организма [4]. При оценке загрязнения водной среды в качестве тест-объектов наиболее часто используют культуры микроводорослей (Chlorella vulgaris, Scenedesmus quadricauda и т.д. [5; 6]) и зоопланктона (Daphnia magna, Ceriodaphnia affinis и т.д. [7; 8]). При биотестировании на клетках фитопланктона, как правило, учитывается скорость прироста численности и концентрация хлорофилла в исследуемых пробах [9]. Внедрение флуориметрических методов анализа не только позволяет оценить количественные показатели тест-культуры, но также отражает протекание первичных фотосинтетических процессов, которые гораздо более чувствительны к изменению условий окружающей среды [10–12]. Регистрация флуоресценции хлорофилла является неинвазивным, не требующим тщательной пробоподготовки, информативным методом [13; 14], который применим для природных поверхностных вод, подверженных различной степени загрязнения [15; 16]. Как следствие, токсическое действие загрязнителей может быть выявлено на более ранних этапах исследования.

Таким образом, целью работы являлось проведение биотестирования токсичности проб воды на культуре клеток Chlorella vulgaris с применением методов флуориметрического анализа.

Материалы и методика исследований

Оценку токсичности поверхностных вод исследуемого водохранилища производили с учетом всех крупных притоков, включая основной – р. Булавин (рис. 1). Точки отбора проб располагались на русле реки Булавин до впадения в водохранилище (точки 1 и 3) и после него (точка 7). К числу притоков Волынцевского водохранилища относятся балки Хацапетовская и Еленовская (точки 4 и 5 соответственно), а также балка Должик, впадающая в реку Булавин непосредственно перед вхождением в водохранилище (точка 2).

 

Рисунок 1 – Мониторинговые точки Волынцевского водохранилища и его притоков

 

Перед выполнением биотестирования из проб воды получали фильтрат путем предварительного пропускания через ацетилцеллюлозные мембранные фильтры типа МФАС-ОС-4 фирмы «Владипор» с диаметром пор 0,6 мкм с целью удаления зоопланктона и клеток природного фитопланктона.

При оценке токсичности проб воды за основу были взяты рекомендации Р 52.24.808-2014 [9]. В отличие от предложенных рекомендаций, вместо спектрофотометрического определения содержания хлорофилла a в исследуемых пробах, выполняли флуориметрическое определение содержания фотопигмента, а также регистрировали кривые индукции флуоресценции и световые кривые флуоресценции хлорофилла с целью более точного определения состояния тест-культуры фитопланктона не только на основании количественных показателей роста, но и по фотосинтетической активности клеток фитопланктона. В качестве тест-объекта использовали культуру зеленых микроводорослей Chlorella vulgaris. Токсичность проб выявляли при непрерывном биотестировании. О степени токсичности проб воды судили по изменению указанных показателей тест-культуры в зависимости от длительности экспозиции. Если коэффициенты прироста количества хлорофилла и численности клеток Chlorella vulgaris отклонялись от контрольных значений, констатировали токсическое действие фильтрата из исследуемой мониторинговой точки [9]. Если отклонение показателей прироста тест-культуры происходило спустя 24 часа культивирования, токсическое действие фильтрата считали острым, если спустя 96 часов – хроническим.

Для контрольных тест-культур вместо фильтрата из исследуемых экспериментальных проб использовали дистиллированную воду. Культивирование контрольных и экспериментальных проб проводили совместно, в одинаковых условиях: при температуре +20 ± 2°C и освещении от 2000 до 3000 лк со световым режимом 12/12 часов. Перед экспериментом проверяли чувствительность культуры микроводорослей воздействием эталонного токсиканта – калия двухромовокислого [9].

Подсчет численности клеток фитопланктона выполняли в камере Горяева. Флуориметрический анализ проб воды проводился с помощью флуориметров Phyto-PAM (Walz, Германия) и ФС-2 (СКТБ «Турбулентность» ДонГУ). Световые кривые регистрировали на основании встроенного протокола измерений для Phyto-PAM с постепенным (каждые 10 секунд) повышением интенсивности действующего света (далее ФАР – фотосинтетически активная радиация) от 32 до 768 мкмоль фотон м⁻² с⁻¹, оценивая изменение квантового выхода флуоресценции (Fᵥ/Fₘ) и скорости электронного транспорта (ETR). Анализ индукционных кривых выполняли на основании OJIP-теста [17, с. 85–95; 18, p. 452–453] с помощью программы PyPhotoSyn [19]. Достоверность отличий средних значений полученных данных определяли с использованием критерия Вилкоксона [20, с. 54–57].

Результаты исследований и их обсуждение

Оценка содержания хлорофилла и скорости роста тест-культуры Chlorella vulgaris

Согласно результатам биотестирования, острого токсического действия фильтрата проб воды на культуру фитопланктона не выявлено (табл. 1). После 24 часов экспозиции для фильтрата из мониторинговых проб 2 и 6 были получены отклонения в численности клеток от контрольных значений, превышающие границу в 25%, однако прирост хлорофилла в данных пробах не выходил за границы нормы. Для мониторинговых точек 2 и 3 не удалось получить статистически значимое отличие от контроля.

После 96 часов экспозиции хроническое токсическое действие было выявлено для Волынцевского водохранилища. Показатели прироста культуры Chlorella vulgaris снижались на 81% (по численности) и 92% (по приросту хлорофилла) относительно контроля (табл. 1). Также интенсивное угнетающее действие оказывали пробы воды из балки Должик (точка 2) и р. Булавин (точка 7), для которых были получены достоверные отклонения от контрольных значений. Коэффициент прироста хлорофилла отличался от контроля менее чем на 50%, что не позволяет установить хроническое токсическое действие данных проб. Стимулирующее рост культуры действие оказывал фильтрат из балок Хацапетовская и Еленовская (точки 4 и 5, соответственно), а также на участке р. Булавин до водохранилища (точка 1). Такой эффект можно объяснить высоким содержанием биогенных веществ, в частности нитратов, в данных мониторинговых точках.

 

Таблица 1 – Результаты биотестирования токсичности проб воды на культуре Chlorella vulgaris

Экспозиция	Исследуемые пробы	Количество клеток, отклонение от контроля, %	Концентрация хлорофилла a, отклонение от контроля, %	Токсическое действие
24 ч.	Контроль	–	–	–
	Точка 1	−16,9	4,8*	нет ОТД
	Точка 2	−37,5	1,9	нет ОТД
	Точка 3	−8,1	1,6	нет ОТД
	Точка 4	−0,9	4,5*	нет ОТД
	Точка 5	−17,5*	2,6	нет ОТД
	Точка 6	−45,1*	−6,6*	нет ОТД
	Точка 7	−20,5	9,3*	нет ОТД
96 ч.	Контроль	–	–	–
	Точка 1	13,9*	29,3*	нет ХТД
	Точка 2	−66,6*	−26,6*	нет ХТД
	Точка 3	−4,3	17,1*	нет ХТД
	Точка 4	17,3	38,7*	нет ХТД
	Точка 5	68,0*	15,4*	нет ХТД
	Точка 6	−81,0*	−92,0*	ХТД
	Точка 7	−37,5*	−29,7*	нет ХТД

Примечание. * – отличия от контроля достоверны согласно критерию Вилкоксона при α = 0,05; полужирным выделены превышения степени отклонения от контроля.

 

Таким образом, выявлено хроническое токсическое действие фильтрата водохранилища на тест-культуру Chlorella vulgaris. Кроме того, выявлен ряд мониторинговых точек, оказывающих стимулирующее рост культуры действие – точки 2, 5 и 4, а также снижающее интенсивность ростовых процессов – точки 2 и 7, для которых токсическое действие согласно стандартной методике биотестирования выявить не удалось. Для определения состояния клеток тест-культуры использовали метод флуориметрии, как инструмент для оценки фотосинтетической активности микроводорослей и определения функционального состояния фотосистемы II.

Регистрация световых кривых флуоресценции тест-культуры Chlorella vulgaris

После 24 часов экспозиции достоверных отличий от контрольных значений не выявлено как для квантового выхода, так и для скорости электронного транспорта (рис. 2: А и Б).

 

Рисунок 2 – Световые кривые квантового выхода флуоресценции хлорофилла a (А) и скорости электронного транспорта – ETR (Б) после 24 часов экспозиции

 

После 96 часов биотестирования наблюдали снижение максимальной скорости электронного транспорта для проб из мониторинговых точек 2 и 3 (см. рис. 3: Б). При низких интенсивностях действующего света показатели ETR соответствовали контрольным значениям тест-культуры. При повышении интенсивности ФАР до 664 мкмоль квант/м²с наблюдали снижение данного параметра для проб из балки Должик и р. Булавин (точка 3). Для данных проб также наблюдали снижение квантового выхода, которое проявлялось при ФАР 464 мкмоль квант/м²с и выше (см. рис. 3: А).

 

Рисунок 3 – Световые кривые квантового выхода флуоресценции хлорофилла a (А) и скорости электронного транспорта – ETR (Б) после 96 часов экспозиции

 

Фильтрат из низовья водохранилища оказывал выраженное угнетающее действие на клетки тест-культуры (рис. 3: А и Б). Квантовый выход флуоресценции клеток колебался в пределах около 0,3–0,1 ед., а максимальная скорость электронного транспорта составляла не более 60 отн. ед., что в два раза ниже контрольных значений. На фоне снижения общей численности клеток для данной пробы (табл. 1) происходило значительное снижение фотосинтетической активности тест-культуры.

Метод регистрации световых кривых позволяет выполнить первичный анализ фотосинтетической активности клеток фитопланктона, а также дает возможность оценить изменения в процессах светоадаптации тест-культуры. На основании квантового выхода и ETR можно судить о различиях между эффектами, оказываемыми фильтратом из разных мониторинговых точек. При этом негативное воздействие фильтрата наблюдали не только для мониторинговой точки 6, оказывающего хроническое токсическое действие согласно методике [9], но и для других проб. Больше информации об изменениях в фотосинтетическом аппарате клеток способен дать OJIP-тест.

Регистрация кривых индукции флуоресценции хлорофилла тест-культуры Chlorella vulgaris

На рисунке 4 приведены некоторые параметры OJIP-теста тест-культуры Chlorella vulgaris после 24 и 96 часов экспозиции. Все представленные результаты нормированы на контрольные значения.

 

Рисунок 4 – Некоторые параметры OJIP-теста для тест-культуры Chlorella vulgaris после 24 часов (А) и 96 часов (Б) экспозиции

 

Для тест-культуры фильтрата Волынцевского водохранилища были характерны более низкие интенсивности флуоресценции (рис. 4: А). Согласно результатом стандартной методики биотестирования для данной пробы происходило наибольшее замедление скорости прироста численности тест-культуры (табл. 1), что объясняет более низкие значения интенсивности флуоресценции. Также значимые отличия уровня Fₘ были выявлены для мониторинговой точки 3.

Параметры, отражающие эффективность функционирования фотосинтетического аппарата (Fᵥ/Fₘ, PI), на данном этапе исследования были неинформативны (рис. 4: А). Достоверные отличия индекса PI от контроля были получены только для мониторинговой точки 6.

Для всех проб наблюдали возрастание параметра Area. Однако по изменению лишь одного параметра трудно судить о конкретных изменениях в фотосистеме II. Как правило, изменения Area сопряжены с параметром Sₘ, отражающим емкость пула электронных акцепторов [17, с. 90–91]. Достоверных отличий от контроля для Sₘ выявлено не было.

Таким образом, несмотря на отсутствие острого токсического действия для фильтрата из мониторинговых точек 3 и 6, наблюдали снижение интенсивности флуоресценции хлорофилла, а также характерное для всех исследуемых проб возрастание параметра Area.

После 96 часов экспозиции наблюдали значимые отклонения уровней минимальной (F₀) и максимальной (Fₘ) флуоресценции от контроля для всех мониторинговых точек, кроме точки 5 (рис. 4: Б). Снижение интенсивности флуоресценции было характерно для проб из балки Должик (точка 2), Волынцевского водохранилища (точка 6) и р. Булавин (точка 7). Значения интенсивности флуоресценции для мониторинговой точки 6 были значительно ниже контроля, снижение параметров F₀ и Fₘ (рис. 4: Б) сопоставимо со снижением численности клеток тест-культуры и содержанием хлорофилла (табл. 1). К повышению показателей F₀ и Fₘ приводило воздействие фильтрата из мониторинговых точек 1, 3 и 4. Коэффициент прироста численности и концентрации хлорофилла для данных проб был также выше контрольных значений (табл. 1). Причиной интенсификации прироста и флуоресценции клеток тест-культуры может служить присутствие более высоких, в сравнении с другими пробами, концентраций нитрат-ионов.

Значения параметра Area изменялись в соответствии с уровнями флуоресценции. Для проб с низкой интенсивностью флуоресценции и площадью над кривой индукции получены высокие значения максимальной скорости восстановления первичного хинонного акцептора Qₐ (параметр M₀). Однако вероятность транспорта электронов за пределы Qₐ была выше только для мониторинговых точек 4, 5 и 6 (параметр Ψ₀). Параметры M₀ и Ψ₀ отражают функционирование электрон-транспортной цепи на участке до и после Qₐ и, следовательно, должны изменяться согласованно.

Для клеток тест-культуры, выращенных на фильтрате из водохранилища, балки Должик и р. Булавин (точки 1, 3 и 7), было характерно снижение показателей эффективности функционирования фотосинтетического аппарата. Низкие значения общего фотосинтетического индекса производительности было получено для фильтрата воды из водохранилища – индекс PI был ниже контрольных значений в 5 раз. Согласованно с индексом PI происходило изменение квантового выхода флуоресценции (рис. 4: Б).

Отдельно стоит выделить стимулирующее действие фильтрата воды из балок Хацапетовская и Еленовская. Для данных проб были получены наиболее высокие показатели как интенсивности флуоресценции, так и параметров эффективности функционирования фотосинтетического аппарата фитопланктона (PI и Fᵥ/Fₘ). Согласно всем методам исследования в мониторинговой точке 4 были наиболее благоприятные условия для развития фитопланктона. Это отражалось как на численности и видовом разнообразии природной альгофлоры, так и на показателях прироста и флуоресценции тест-культуры Chlorella vulgaris.

На основании анализа кривых индукции флуоресценции хлорофилла при биотестировании было установлено негативное воздействие фильтрата из Волынцевского водохранилища, р. Булавин и балки Должик, а также стимулирующее действие фильтрата из северных притоков водохранилища.

Заключение

При оценке изменения содержания хлорофилла и скорости прироста численности тест-культуры Chlorella vulgaris, после 96 часов экспозиции, установлено токсическое действие фильтрата воды из Волынцевского водохранилища. Метод регистрации световых кривых флуоресценции дополняет стандартную методику, подтверждая негативное воздействие фильтрата из точки 6 на клетки фитопланктона, а также выявляя негативное воздействие фильтрата из балки Должик и р. Булавин на скорость электронного транспорта и квантовый выход клеток тест-культуры.

При оценке параметров кривых индукции флуоресценции было подтверждено негативное воздействие проб воды из Волынцевского водохранилища, балки Должик и р. Булавин, а также были получены данные о стимулирующем фотосинтетическую активность воздействии фильтрата из северных притоков водохранилища (точки 4 и 5). Наибольшие изменения в работе фотосистемы II клеток Chlorella vulgaris происходило на участке первичного хинона Qₐ, что выражалось в изменении максимальной скорости его восстановления и снижении вероятности транспорта электронов к вторичному хинону.

При биотестировании проб воды было установлено токсическое действие на тест-культуру. Но при этом также были получены результаты, указывающие на негативное воздействие на физиологическое состояние фитопланктона проб воды, для которых не было установлено достоверного токсического действия. Таким образом, результаты флуориметрических методик регистрации световых и индукционных кривых флуоресценции хлорофилла согласуются с результатами рекомендуемой методики биотестирования, но кроме того дают возможность получить более полное представление о состоянии тест-объекта, описывая изменения в функциональном состоянии фотосинтетического аппарата и эффективности его функционирования.

About the authors

Sergey Viktorovich Chufitskiy

Donetsk State University

Author for correspondence.
Email: chufitsky@donnu.ru

senior lecturer of Biophysics Department

Russian Federation, Donetsk

Svetlana Vladimirovna Bespalova

Donetsk State University

Email: bespalova@donnu.ru

doctor of physical and mathematical sciences, professor, rector

Russian Federation, Donetsk

Sergey Mikhailovich Romanchuk

Donetsk State University

Email: s.romanchuk@donnu.ru

candidate of technical sciences, director of Special Design and Technology Bureau «Turbulence»

Russian Federation, Donetsk

References

Supplementary files