Specific features of in vitro micropropagation of various representatives of the genus Rhododendron

Full Text

Введение

В настоящее время все больше городских и частных территорий подвергается озеленению, которое имеет большое значение в архитектурно-планировочном и санитарно-гигиеническом планах, позволяет улучшить социальные и эстетические качества облагораживаемой территории [1; 2, с. 323; 3, с. 150]. Особый интерес представляют новые виды, сорта и гибриды растений, обладающие высокодекоративными качествами [4, с. 451]. Одним из первоклассных материалов для озеленения является род Rhododendron L. – крупнейший в семействе Вересковые (Ericaceae Juss.), включающий около 1300 вечнозеленых, полувечнозеленых и листопадных видов и более 10 тыс. сортов [5; 6, с. 26].

Рододендроны относятся к трудно укореняемым растениям, поэтому вегетативные методы размножения (прививки, черенкование, отводки, деление куста) не подходят для получения качественного посадочного материала [4, с. 451–452; 7, с. 17]. Чтобы получить большее количество сортового посадочного материала, необходимо иметь много маточных растений, причем эти растения должны быть достаточно крупными, с ветвями, низко расположенными у земли [8]. Наиболее эффективным методом массового воспроизводства рододендронов в настоящее время является клональное микроразмножение, позволяющее в относительно короткие сроки получать большее количество однотипных здоровых саженцев [9, p. 9; 10; 11, с. 63].

Цель данного исследования – подбор оптимального гормонального состава среды для вегетативного размножения in vitro представителей рода Rhododendron.

Материалы и методы исследования

В качестве объектов исследований использовались три представителя рода Rhododendron: сорт Rh. Helsinky University, гибрид Rh. hybrid Marianna v. Weizsacker и вид Rh. caucasicum var. Rosea из коллекции растений Ботанического сада ННГУ. Данные представители рода Rhododendron представляют собой морозостойкие вечнозеленые кустарники с обильным цветением крупными соцветиями [12, p. 111–112; 13, с. 145; 14]. Растения обладают высокодекоративными качествами, способны произрастать в умеренно холодном климате, поэтому являются подходящим вариантом для озеленения. Исследование проводились на базе лаборатории микроклонального размножения растений Ботанического сада ННГУ в летний период 2021 г. по апрель 2022 г.

Для изучения потенциала вегетативного размножения в условиях in vitro использовалась питательная среда Woody Plant Medium (WPM) [15] (табл. 1). Было приготовлено два варианта среды WPM с добавлением гормонов БАП/ИМК или НУК/КИН в соотношении 1/4 мг/л и контрольный вариант без гормонов. Для каждого объекта исследования использовалось по 10 колб каждого варианта среды (2 экспериментальные + контроль), в которые пересаживали по 10 растений высотой 10 мм. Растения культивировались в помещении при световом режиме 16/8 при t +20°C.

 

Таблица 1 – Пропись питательной среды WPM [15]

Компонент	Концентрация, мг/л
NH₄NO₃	200
MgSO₄ × 7H₂O	185
MnSO₄ × 7H₂O	12,5
KH₂PO₄	85
KSO₄	495
CaCl × 2H₂O	6,355
Ca(NO₃)₂	20
H₃BO₃	3,1
CuSO₄ × 5H₂O	0,0125
NaMoO₄ × 2H₂O	1,25
ZSO₄ × 7H₂O	4,3
FeSO₄ × 7H₂O	27,85
Na₂-ЭДТА	37,25
Мезоинозит	100
Тиамин (В1)	0,8
Пиридоксин (В6)	1
Никотиновая к-та (В3)	1
Сахароза	20000
Агар-агар	8000
Ундевит	500
рН среды 5,5

 

По истечении 4 месяцев происходило снятие результатов и оценка эффективности использования питательных сред с содержанием гормонов (рис. 1).

 

Рисунок 1 – Rh. Helsinky University в начале эксперимента (А) и спустя 4 месяца культивирования на питательной среде с содержанием 1/4 мг/л ИМК/БАП (Б)

 

При помощи цифрового USB микроскопа Oitez DP-M07-200 были сделаны фотографии растений. По полученным фото производилось измерение длины главного побега и корня в программе eScope. Также визуальным методом был проведен подсчет количества листьев и образование побегов II порядка у исследуемых растений. Итоговая оценка достоверности полученных данных осуществлялась при использовании расчета критерия Манна–Уитни с последующим анализом полученных результатов.

Результаты и их обсуждение

По результатам, представленным на графике (рис. 2), у особей Rh. caucasicum var. Rosea наличие в среде гормонов угнетало рост главного побега, особенно это проявилось в группе, культивированной на среде с ИМК/БАП. У Rh. hybrid Marianna v. Weizsacker наблюдались аналогичные результаты. У Rh. Helsinky University, наоборот, наличие в питательной среде фитогормонов, особенно ИМК/БАП, стимулировало рост главного побега растений по сравнению с контрольной группой.

 

Рисунок 2 – Средние значения длины главного побега исследуемых объектов (статистически значимые отличия величин по критерию Манна–Уитни отмечены «*»)

Использование фитогормонов НУК/КИН не оказало значимого эффекта на длину корня у Rh. caucasicum var. Rosea, в то время как использование фитогормонов ИМК/БАП дало отрицательный эффект (рис. 3).

 

Рисунок 3 – Средние значения длины корня исследуемых объектов

 

У Rh. hybrid Marianna v. Weizsacker наличие в питательной среде гормонов не повлияло на рост корней. У Rh. Helsinky University, как и у Rh. caucasicum var. Rosea, наличие в среде фитогормонов угнетало рост главного корня, однако наиболее отрицательный эффект был у группы, культивируемой на среде, содержащей НУК/КИН.По результатам, представленным на графике (рис. 4), у растений Rh. caucasicum var. Rosea содержание в среде фитогормонов ИМК/БАП оказывало негативное воздействие на формирование новых листовых пластинок, в то время как фитогормоны НУК/КИН оказывали пусть и незначительный, но положительный эффект по сравнению с контрольной группой.

 

Рисунок 4 – Среднее значение количества листьев исследуемых объектов (статистически значимые отличия величин по критерию Манна–Уитни отмечены «*»)

 

Содержание в среде фитогормонов, особенно ИМК/БАП, оказывало угнетающий эффект на формирование листьев у Rh. hybrid Marianna v. Weizsacker. У Rh. Helsinky University наибольшее количество листьев наблюдалось у группы растений, культивируемых на среде с фитогормонами ИМК/БАП, а вот содержание в среде НУК/КИН оказывало негативный эффект.У особей Rh. caucasicum var. Rosea образовались побеги второго порядка только в контрольной безгормональной среде (1–2 побега). У Rh. hybrid Marianna v. Weizsacker кущение наблюдалось во всех трех группах. Наибольшее (более 10 побегов II порядка на растение) наблюдалось в экспериментальной группе с концентрацией фитогормонов НУК/КИН 1/4 мг/л, наименьшее кущение в экспериментальной группе с концентрацией фитогормонов ИМК/БАП 1/4 мг/л (2–4 побегов). В контрольной группе наблюдалось среднее значение по кущению (5–8) (рис. 5). У Rh. Helsinky University наибольшее кущение наблюдалось в экспериментальной группе с концентрацией фитогормонов ИМК/БАП 1/4 мг/л, наименьшее в экспериментальной группе с концентрацией фитогормонов НУК/КИН 1/4 мг/л.

 

Рисунок 5 – Rh. hybrid Marianna v. Weizsacker на контрольной среде спустя 4 месяца культивирования

 

На потенциал вегетативного размножения в условиях in vitro может оказывать влияние множество факторов: состав питательной среды, наличие и соотношение гормонов, выбор экспланта, освещение и др. [16, с. 11]. В данном исследовании акцент был сделан на подбор фитогормонов.

В экспериментах использовались ауксины – ИМК (индолил-3-маслянная кислота) и НУК (1-нафталилуксусная кислота) в сочетание с цитокининами – КИН (6-фурфуриламинопурин) и БАП (6-бензиламинопурин) в соотношении 1/4 мг/л. В исследованиях других авторов, помимо этих гормонов, использовались ИУК (индолил-3-уксусная кислота), 2иП (2-изопентиниладенин), Зеатин, ТДЗ (тидиазурон) и др. [4; 6; 9; 17; 18]. Индуцировать прямую регенерацию побегов из эксплантов позволяет оптимальное соотношение цитокининов и ауксинов в среде [19; 20, с. 166]. Это соотношение имеет видоспецифичный характер. Однако чаще встречаются сообщения об успешной прямой регенерации при соотношении цитокининов и ауксинов в среде от 1:1 до 5:1 [21; 22]. При разработке оптимальной методики микроклонального размножения рододендронов учитывается ряд факторов, основными из которых являются размеры растения (длина побега и корня) и коэффициент размножения [17; 22, p. 57]. Во многих исследованиях особое внимание уделяют длине побега и кущению, поскольку образование развитой корневой системы для дальнейшей высадки in vivo зачастую осуществляют отдельным культивированием на обедненной среде или обедненной среде с добавлением ауксинов [17, с. 81; 19, с. 41].

Анализируя длину главного побега у исследуемых объектов, можно сделать вывод, что оптимальной средой для выращивания является контрольная безгормональная среда WPM, за исключением образцов Rh. Helsinky University, оптимальной средой для которых можно считать экспериментальную с комбинацией фитогромонов ИМК/БАП в соотношении 1/4 мг/л. В работе Т.В. Каленчук с соавт. [22] культивирование Rh. hybrid Marianna v. Weizsacker с добавлением ИУК/2иП в соотношении 1/5 мг/л также не дало достоверной положительной динамики для роста побега, хотя наблюдалась тенденция к увеличению длины при уменьшении концентрации регуляторов роста до 0,2/1.

Установлено, что для всех исследуемых видов/ сортов/гибридов рододендронов наиболее эффективным способом укоренения является контрольная безгормональная питательная среда. Но также стоит отметить, что у Rh. hybrid Marianna v. Weizsacker показатели ризогенеза равны как в контрольной, так и в экспериментальной группе с комбинацией фитогормонов ИМК/БАП.

Возможно, характер образование побегов II порядка у исследуемых объектов можно объяснить тем, что используемая нами питательная среда WPM больше подходит для мультипликации гибридов и сортов рода рододендрон. Поэтому у особей Rh. caucasicum var. Rosea, который является видом, образование побегов II порядка наблюдалось только в контрольной безгормональной среде.

Для особей Rh. hybrid Marianna v. Weizsacker, который является гибридом, можно считать наиболее эффективной для мультипликации среду WPM – как контрольную, так и с добавлением регуляторов роста НУК/КИН в соотношении 1/4 мг/л, так как там образовалось наибольшее количество побегов II порядка. В работе Т.В. Каленчук с соавт. [22], где использовались ИУК/2иП для Rh. hybrid Marianna v. Weizsacker в соотношении 1/5, наблюдали наибольшее разрастание каллусной ткани в основании побега, а также образование из нее адвентивных побегов. Увеличение размера каллусной ткани у основания побегов и вследствие этого развитие адвентивных побегов – это нежелательные последствия при размножении сортового материала, так как увеличивается генетическая неоднородность полученного материала. В связи с этим оптимальными при микроклональном размножении являлись среды с более низким содержанием гормонов (0,6/3 мг/л ИУК/2иП).

Для особей Rh. Helsinky University, являющихся сортом, можно считать наиболее благоприятной питательную среду WPM с добавлением регуляторов роста ИМК/БАП в соотношении 1/4 мг/л, так как именно там наблюдалось наибольшее образование клонов. У особей Rh. caucasicum var. Rosea, который является видом, образование побегов II порядка наблюдалось только в контрольной безгормональной среде. Возможно, низкая интенсивность образования побегов II порядка Rh. caucasicum var. Rosea объясняется тем, что используемая нами питательная среда WPM, по-видимому, больше подходит для мультипликации гибридов и сортов рода рододендрон. Многие исследователи при изучении мультипликации рода Rhododendron также используют среду Андерсона [4; 6; 18; 23].

Заключение

Анализ влияния различных концентраций фитогормонов показал, что для вида/гибрида/сорта свойственны свои комбинации и концентрации регуляторов роста. Так, например, для исследуемого объекта Rh. Helsinky University, который является сортом, установлено, что наилучшие показатели роста достигаются на питательной среде с добавлением ИМК/БАП в соотношении 1/4 мг/л. В то время как для образца Rh. caucasicum var. Rosea, являющегося видом, подходит питательная среда WPM без добавлений фитогормонов.

Для успешной мультипликации Rh. Helsinky University установлена комбинация фитогормонов ИМК/БАП в соотношении 1/4 мг/л; для успешной мультипликации Rh. hybrid Marianna v. Weizsacker подходят питательные среды WPM – как контрольная безгормональная, так и с добавлением фитогормонов НУК/Кинетин в соотношении 1/4 мг/л; успешной для мультипликации Rh. caucasicum var. Rosea можно считать питательную среду WPM без добавления регуляторов роста.

About the authors

Daria M. Shilina

National Research Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod

Email: shilina-darya00@mail.ru

master student of Botany and Zoology Department

Russian Federation, Nizhny Novgorod

Vera V. Syrova

National Research Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod

Email: vvsyrova@mail.ru

candidate of biological sciences, associate professor of Botany and Zoology Department, head of Plant Micropropagation Laboratory

Russian Federation, Nizhny Novgorod

Alena E. Makarova

National Research Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod

Author for correspondence.
Email: alena.makarova.95@mail.ru

postgraduate student of Botany and Zoology Department, senior laboratory assistant of Plant Micropropagation Laboratory

Russian Federation, Nizhny Novgorod

Alexander I. Shirokov

National Research Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod

Email: aishirokov@mail.ru

candidate of biological sciences, associate professor of Botany and Zoology Department, director of Botanical Garden

Russian Federation, Nizhny Novgorod

References

Supplementary files