Peculiarities of in vitro parthenogenesis of unpollinated maize ovaries

Full Text

Введение

В настоящее время культура изолированных органов и тканей растений in vitro является одним из популярных способов производства гаплоидов, которые необходимы для ускоренного создания гомозиготных линий и выведения на их основе новых сортов и гибридов. Гаплоиды с материнским геномом для многих видов были получены при культивировании in vitro завязей и семязачатков [1; 2]. Однако для кукурузы этот метод все еще остается недостаточно разработанным. Успешных результатов удавалось достичь лишь в единичных случаях [3–6]. Эффективность культивирования может зависеть от целого ряда факторов. В многочисленных исследованиях показана определяющая роль генотипа донорных растений, типа экспланта и состава питательных сред на процессы регенерации [1]. Несомненно, это далеко не полный список.

Целью настоящей работы являлось определение факторов, влияющих на партеногенетическое развитие зародышей в стерильной культуре неопылённых завязей кукурузы линии АТ-1.

Материалы и методика исследований

Данная линия была получена в Отделе генетики и репродуктивной биологии УНЦ «Ботанический сад СГУ» (г. Саратов). Она характеризуется наследственной предрасположенностью к матроклинной гаплоидии. В неоплодотворенных зародышевых мешках яйцеклетки могут автономно делиться и давать начало гаплоидным глобулярным проэмбрио. Количество таких яйцеклеток возрастает при увеличении сроков задержки опыления. При этом их дальнейшее развитие in vivo невозможно без полноценного эндосперма, который формируется только после оплодотворения центральной клетки. Эмбриологическое развитие у линии АТ-1 в некоторой степени сходно с псевдогамным апомиксисом [7].

Растения-доноры выращивали по правилам селекционной работы (делянки 4 ряда по 15–20 растений) в условиях открытого грунта на экспериментальном поле ФГБНУ РОСНИИСК «РОССОРГО». Початки до появления рылец закрывали пергаментными изоляторами. В культуру вводили неопылённые завязи определенного «возраста». За «возраст завязи» принимали длительность задержки опыления с момента вымётывания рылец. Всего было апробировано 6 вариантов сроков задержки опыления: 1, 3, 5, 7, 10 и 15 суток. После удаления обёрточных листьев и пестичных нитей соцветия обрабатывали последовательно дезинфицирующими растворами: 70% этанолом (10 сек.), водным раствором (50 мг/л) натриевой соли этилмеркуртиосалициловой кислоты (7 мин.) с последующей трёхкратной промывкой стерильной дистиллированной водой. Использовали завязи только из средней части початка приблизительно одного размера. Питательная среда включала минеральные компоненты MS [8], витамины, агар-агар, сахарозу (9,0%), 2,4-Д (2,0 мг/л) при уровне рН 5,8–6,1. В каждом варианте по 20–30 завязей фиксировали в ацеталкоголе (1:3) темпорально: непосредственно перед инокуляцией и спустя 3, 7, 14, 21, 28 суток. Цитоэмбриологическое исследование проводили на препаратах зародышевых мешков, выделенных из семязачатков методом ферментативной мацерации [9], а также на постоянных микротомных препаратах [10; 11], которые анализировали с помощью микроскопа «Axiostar Plus» (Carl Zeiss, Германия).

Результаты и их обсуждение

Установлено, что до начала культивирования завязи с задержкой опыления 1–3 суток содержали зрелые зародышевые мешки типичного строения с яйцеклеткой, двумя синергидами, центральной клеткой с двумя полярными ядрами и антиподальным комплексом из 20 и более клеток. В 5–15-суточных завязях встречались зародышевые мешки с делящимися яйцеклетками или проэмбрио. Анализ культивируемых завязей показал, что суммарный «возраст» завязей, который включает время задержки опыления до эксплантации и период культивирования, является фактором, определяющим вероятность партеногенетического развития зародышей. В некоторых зародышевых мешках присутствовали два проэмбрио. Причиной их появления могло быть формирование в зародышевом мешке дополнительных яйцеклеток, яйцеклетокоподобных синергид или независимые деления в дериватах яйцеклетки [12].

В женских гаметофитах полярные ядра оставались неслившимися вплоть до достижения завязями суммарного возраста 5–7 суток. При этом зародышевые мешки могли содержать как интактную яйцеклетку, так и 2–60 клеточный зародыш. На 7–8 сутки происходило слияние полярных ядер, а на более поздних сроках уже обнаруживались пролиферативные процессы в центральной клетке, которые приводили к образованию ценоцитов. В редких случаях отмечали фрагменты многоклеточного эндосперма. Результатом асинхронности инициации яйцеклетки и центральной клетки к автономному развитию являлось формирование трёх типов зародышевых мешков: 1) с зародышем и эндоспермом; 2) с проэмбрио и без эндосперма; 3) с эндоспермом, но без зародыша. Как ни парадоксально, но развитие эндосперма в культивируемых завязях приводило к гибели зародыша. Скорее всего, неполноценный эндосперм не только не мог служить для зародыша источником питания, но и, обволакивая его, препятствовал использованию зародышем искусственной питательной среды.

При отсутствии эндосперма процесс эмбриогенеза мог идти по одному из двух направлений: 1) зародыш прорастал и давал начало гаплоидному растению; 2) на поверхности проэмбрио формировались многочисленные эмбриоиды, дающие начало гаплоидным растениям-регенерантам. Прямое прорастание зародышей происходило очень редко и, как правило, заканчивалось на стадии появления зародышевого корешка и колеоптиля. Формирование эмбриоидов наблюдали только на многоклеточных проэмбрио, которые культивировались на питательной среде не менее 7 суток. В завязях, инокулированных в «возрасте» 1–3 суток, такие зародыши формировались только через 3–4 недели культивирования, а в 15-суточных завязях – через 1 неделю (рис. 1). Таким образом, фактором определяющим способность зародышей к образованию эмбриоидов, является их суммарный возраст.

Рисунок 1 – Сроки возникновения эмбриональных структур в завязях кукурузы линии АТ-1 in vitro

Процесс возникновения эмбриоидов имеет сходство с соматическим эмбриоидогенезом, характерным для культуры зиготических зародышей. У кукурузы эмбриоиды могут возникать либо из клеток каллуса, производного от поверхностных тканей зиготических зародышей [13–18], либо непосредственно из эпидермальных и субэпидермальных клеток щитка [19]. Несмотря на существование большого числа версий об инициалях эмбриоидов [20], вопрос их происхождения для каждого случая остаётся открытым. Нами установлено, что в субэпидермальном слое партеногенетического зародыша выделяются клетки, которые делятся периклинально, образуя комплекс. Сначала он разрастается в виде бугорка на поверхности проэмбрио (рис. 2: а), а затем отделяется от него перетяжкой (рис. 2: б).

Рисунок 2 – Разные стадии формирования эмбриоидов на партеногенетическом зародыше линии кукурузы АТ-1 in vitro: а – стадия «бугорка»; б – появление перетяжки (пер), начало обособления от ткани материнского зародыша

Если клеток-инициалей появляется множество, то и при их синхронном делении возникает одновременно и множество эмбриоидов. Находясь здесь же, на поверхности материнского зародыша, эмбриоиды либо прорастают, либо отпочковывают эмбриоиды новых порядков. Эмбриоидогененная масса в этом случае, увеличиваясь в объёме, нередко выходила из-под лопнувшего перикарпа. Периодическая по мере необходимости пересадка эмбриоидогенных комплексов (ЭГК) на свежую питательную среду MS, содержащую 2,0% сахарозы и 2,0 мг/л 2,4-Д, позволяла поддерживать длительное время культуру регенерационноспособных эмбриоидогенных штаммов.

В ткани разросшегося зародыша было отмечено также заложение почек с элементами проводящей системы (рис. 3), но регенерации путём геммогенеза при этом не наблюдалось.

Рисунок 3 – Заложение почки в ткани партеногенетического проэмбрио

Представляет интерес тот факт, что партеногенетически возникший зародыш и в случае прямого эмбриогенеза, и эмбриоидогенеза реализовывал программу развития в сокращённом варианте: останавливался на глобулярной стадии. Его дальнейшее развитие отличалось от развития гибридных диплоидных зародышей кукурузы in vivo. Отмечалась даже некая параллель между онтогенезом зародыша в системе завязи in vitro и зародыша без эндосперма у паразитных растений. Партеногенетический зародыш в условиях экзогенного питания in vitro претерпевал структурные преобразования, соответствующие его условиям питания. Так, возникший при прямом эмбриогенезе зародышевый корешок несколько видоизменялся, утолщаясь и покрываясь каллусом, подобно корням растений-паразитов [21].

Такая дивергенция в развитии проэмбрио может быть объяснена большой пластичностью поведения его клеток, наличием в зародыше различных морфогенетических потенциалов.

Известно, что путь морфогенеза, реализованный в экстремальных условиях для того или иного вида растений, определяется его физиологическими, генетическими характеристиками и условиями выращивания [22]. Важную роль в этом играют и фитогормоны. Мы полагаем, что присутствие в среде ауксина 2,4-Д провоцировало активное образование эмбриоидов и блокировало формирование растений путём прямого эмбриогенеза. Уже на исходной среде эмбриоиды могли прорастать, давая начало растениям-регенерантам. Более интенсивное прорастание эмбриоидов и укоренение регенерантов происходило, если эмбриоиды переносили на свежую питательную среду, содержащую не 2.4-Д, а β-индолилуксусную кислоту (ИУК) и кинетин в равных количествах (по 1 мг/л).

Вывод

Определяющими факторами, способствующими реализации наследственной предрасположенности линии кукурузы АТ-1 к партеногенезу в культуре неопыленных завязей, являются: 1) суммарный «возраст» завязи (способность партеногенетических проэмбрио к эмбриоидогенезу может проявляться при эксплантации завязей в возрасте от трёх и до 15 суток, при этом в более старых завязях эмбриоидогенез начинается в более ранний период культивирования in vitro); 2) отсутствие эндосперма в культивируемых зародышевых мешках, так как по причине своей аномальности он препятствует развитию зародыша.

Использование метода культуры неопылённых завязей для линии кукурузы АТ-1 очень перспективно, так как позволяет в короткие сроки получить в массовом количестве гаплоидные растения-регенеранты. Большое преимущество данной линии состоит в наличии у неё наследственной тенденции к партеногенезу. Это даёт основание полагать, что культура неопылённых завязей партеногенетических форм может быть перспективным методом массового производства гаплоидных регенерантов и у других видов сельскохозяйственных растений.

About the authors

Tatyana Alekseevna Alatortseva

Author for correspondence.
Email: alatortsevata@mail.ru

candidate of biological sciences, associate professor of Chair of Genetics

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Figure 1 - The timing of the emergence of embryonic structures in the ovaries of maize line AT-1 in vitro

Download (51KB)

Indexing metadata

3. Figure 2 - Different stages of embryoid formation on the parthenogenetic embryo of the AT-1 maize line in vitro: a - the stage of "tubercle"; b - the appearance of a constriction (per), the beginning of separation from the tissue of the maternal embryo

Download (44KB)

Indexing metadata

4. Figure 3 - Laying of the kidney in the tissue of the parthenogenetic proembryo

Download (21KB)

Indexing metadata