The chemicals (formaldehyde and toluene) influence on soil microorganisms of leached chernozem

Natalya Anatolyevna Ilyina; Ильина Наталья Анатольевна; Tatyana Valentinovna Fufaeva; Фуфаева Татьяна Валентиновна; Natalya Anatolyevna Kazakova; Казакова Наталья Анатольевна; Nataliya Mikhailovna Kasatkina; Касаткина Наталия Михайловна; Evgeniya Alexandrovna Vilkova; Вилкова Евгения Александровна

doi:10.17816/snv20163104

The chemicals (formaldehyde and toluene) influence on soil microorganisms of leached chernozem

Authors: Ilyina N.A.¹, Fufaeva T.V.¹, Kazakova N.A.¹, Kasatkina N.M.¹, Vilkova E.A.¹
Affiliations:
1. Ulyanovsk State Pedagogical University
Issue: Vol 5, No 3 (2016)
Pages: 21-25
Section: 03.02.00 – General Biology
URL: https://snv63.ru/2309-4370/article/view/21925
DOI: https://doi.org/10.17816/snv20163104
ID: 21925

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

The paper assesses the status of the soil cover associated with the pollution of its waste chemical production and consumption. The authors present the data of formaldehyde and toluene influence on the abundance of actinomycetes, heterotrophic bacteria and fungi, as these groups of microorganisms provide self-purification capacity of the soil and participate in soil formation processes. In this paper microbiological and physico-chemical methods of research are used. The study of species composition changes of some soil microorganisms groups of leached chernozem under the influence of formaldehyde and toluene showed that this factor causes changes in the complex of soil microorganisms. This factor is reflected in the decreased species richness and diversity and increase of pollution-tolerant microorganisms. These studies investigate a number of microorganisms that provide self-purification capacity of the soil and participate in soil formation. The results show the nature of the influence of different doses of formaldehyde and toluene on the structure and functioning of the complex of soil microorganisms, as well as reveal the mechanism of action of chemicals (formaldehyde and toluene) on soil microbiota associated with its resistance and the manifestation of toxicity of the soil.

Keywords

soil, leached chernozem, soil formation process, formaldehyde, toluene, heterotrophic bacteria, actinomycetes, fungi, soil microorganisms, xenobiotics, species richness, self-purification ability, soil formation, soil microbiota, soil toxicity, biochemical value

Full Text

Почва – одно из богатств, которыми располагает человек. Поэтому для человека важно изучение почвы как источника нашего пищевого благосостояния. Вместе с тем проявляется тенденция к уменьшению площадей плодородных земель вследствие ветровой и водной эрозии, а также загрязнения почвенного покрова человеком химическими веществами и отходами химических производств [2; 3].

Почвенный покров выполняет важные функции: биологического поглотителя, разрушителя и нейтрализатора загрязнений различного рода. Если данное звено биосферы будет разрушено, то сложившееся функционирование биосферы необратимо нарушится [4]. В связи с этим чрезвычайно важно изучение глобального биохимического значения почвенного покрова, его современного состояния и изменения под влиянием антропогенной деятельности человека, так как важнейшим значением почв является аккумулирование органического вещества, различных химических элементов, энергии. Охрана почв от загрязнений является наиболее важной задачей человека, так как любые вредные соединения и вещества, находящиеся в почве, рано или поздно попадают в организм человека [5; 6].

Проблема оценки состояния почвенного покрова, связанная с загрязнением ее отходами химического производства и потребления, выбросами от стационарных и передвижных источников, применения агрохимикатов, является весьма актуальной [1].

В данной работе были использованы микробиологические и физико-химические методы исследований. Отбор почвы проводили в соответствии с ГОСТ 28168-89 [7].

Формальдегид определяли согласно методике СанПиН 42-128-4433-87 [8].

Определение толуола проводили в соответствии с методическими указаниями (определение массовых долей бензола и толуола в пробах почвы) [9; 10].

Статистическую обработку данных проводили с помощью встроенного статистического пакета Excel (MSOffice 2007). Повторность всех экспериментов трехкратная.

Исследования проб загрязненных почв направлены на изучение влияния химических веществ (формальдегид и толуол) на численность актиномицетов, гетеротрофных бактерий и плесневых грибов, так как эти группы микроорганизмов обеспечивают самоочищающую способность почвы и участвуют в почвообразовательных процессах.

Численность почвенных микроорганизмов, содержащей различные концентрации загрязнителя, определяли методом последовательных разведений почвенной суспензии на 5 и 30 сутки [11].

Плесневые грибы выявляли поверхностным методом, высевая 0,1 мл почвенной суспензии из разведения 10–2 на агаризованную среду Чапека-Докса. Актиномицеты выделяли так же, как и грибы, поверхностным методом, высевая 0,1 мл из разведения 10–3 на среду Красильникова № 1 [12]. Гетеротрофные бактерии выявляли глубинным методом посева 1 мл суспензии из разведения 10–5 на ГРМ-агар. Культивирование посевов осуществляли в термостате при 25 0С в течение 2 суток при выделении гетеротрофных, 5–7 суток при выделении актиномицетов и плесневых грибов. После инкубации посевов проводили количественный учет выросших колоний и определяли КОЕ в 1 г почвы. Динамику численности микроорганизмов в почве с ксенобиотиком отражали в процентах по отношению к контролю.

После 4 (с формальдегидом) и 8 (с толуолом) пассажей соответственно, в новую питательную среду из культуральной жидкости с накопительной культурой производили высев на чашки Петри с элективной твердой агаризованной средой М9 + формальдегид (толуол) и отбирали изолированные колонии.

Определение систематического положения отобранных штаммов бактерий проводится в соответствии с определителем бактерий Берги [13; 14; 15] по настоящее время.

При взаимодействии формальдегида с плесневыми грибами отмечено стимулирующее действие максимальных концентраций загрязнителя. При внесении 100 и 1000 доз ПДК увеличивалось количество плесневых грибов на 10–30%, а в почве, содержащей 10 дозу ПДК, в первые дни численность грибов уменьшилась. На 30 сутки было отмечено снижение содержания грибов во всех пробах почвы с формальдегидом, особенно выделялись грибы из родов Mucor и Penicillium. Вероятнее всего, образующиеся продукты разложения обладали сильным токсическим действием на плесневые грибы.

Еще большее токсическое действие, особенно в первые дни контакта оказывал толуол на плесневые грибы, так как их содержание в пробах почвы снизилось на 30–80%. Однако при дальнейших наблюдениях численность плесневых грибов не только восстанавливалась, но даже превысила контрольные показатели. При этом восстановление численности происходило в основном у родов Mucor и Penicillium. В пробе, содержащей 1000 доз ПДК, численность восстанавливалась с меньшей интенсивностью.

Анализ динамики численности актиномицетов, после внесения различных доз формальдегида показал ингибирующее действие на их размножение. На протяжении всех 30 суток отмечено непрерывное снижение количества актиномицетов в пробах с формальдегидом. К 30 дню наблюдалось уменьшение до 97% численности актиномицетов во всех пробах почвы. Таким образом, действие формальдегида выражается в негативном действии на их размножение.

Совершенно иную динамику изменения численности наблюдали у актиномицетов, так как в первые дни контакта с толуолом их количество оставалось на исходном уровне, но к 30 дню произошло нарастание численности в условиях внесения всех трех доз ПДК (10, 100 и 1000 доз ПДК). При этом интенсивное накопление актиномицетов наблюдалось при внесении повышенных доз ПДК.

Установлено, также, что на протяжении 30 суток происходило увеличение содержания гетеротрофных бактерий после внесения в нее доз формальдегида. Так в течение 30 суток наблюдали увеличение содержания гетеротрофных бактерий в почве. Внесение в почву концентрации 10 ПДК не сразу отразилось на размножение бактерий. В почве с максимальными дозами (100 и 1000 мг/кг) уже на пятые сутки количество бактерий на 10–45% превышало контрольные значения, так к 30 дню численность гетеротрофов во всех пробах почвы увеличилась до 147–154%.

Микробиологическими исследованиями проб почвы в различные интервалы времени установлено, что при внесении в почву толуола стимулировало рост, и размножение гетеротрофных бактерий в пробах почвы с ксенобиотиком на 5 сутки увеличивалась в 3–5 раз по сравнению с контролем, при этом выявлена зависимость размножения бактерий от дозы препарата.

Особенно высокое содержание микробов – 480% было зафиксировано в почве, содержащей максимальную концентрацию в 1000 доз ПДК, что соответствовало 300 мг/кг. Количественные показатели бактерий в пробах почвы, содержащей 10 и 100 ПДК толуола, соответствующие 3 и 30 мг/кг, численно совпадали и составляли 345% от контроля. К 30 дню содержание микробов в почве несколько снижалось, но, тем не менее, оставалось довольно высоким, это дает основание полагать, что толуол способствовал активному размножению гетеротрофных бактерий.

После 4 пассажа на новую питательную среду из культуральной жидкости с накопительной культурой производили высев на чашки Петри с элективной твердой агаризованной средой М9 + формальдегид и отбирали изолированные колонии. Вследствие чего, удалось получить 2 изолята, которые устойчивы к формальдегиду в концентрации 50 мг/л. Они были исследованы на способность к деструкции в условиях непрерывного культивирования в аэробных условиях на минеральной среде М9. Выделенные 2 штамма бактерий были обозначены под шифрами Фд 1 и Фд 2 – это тонкие грамотрицательные палочки, которые на агаре Хоттингера с pH 7,6 через 24 часа инкубации при температуре плюс 28oC вырастают матовые, бугристые, с фестончатым краем колонии, дающие цветочный запах.

Так как формалин является раствором формальдегида, то выделенные штаммы деструкторы формальдегида (Фд 1 и Фд 2) использовали для ремедиации земель, загрязненных формалином.

Результаты исследования показывают, что после 48 часов инкубирования штаммы Фд 1 и Фд 2 разрушают 10 мг/л и 15 мг/л формальдегида. Изменение концентрации формальдегида при росте штаммов деструкторов Фд 1 и Фд 2 показано на рисунке 1.

Рисунок 1 – Изменение концентрации формальдегида при росте штаммов деструкторов Фд 1 и Фд 2

После 8 пассажей в новую питательную среду из культуральной жидкости с накопительной культурой производили высев на чашки Петри с элективной твердой агаризованной средой М9 + толуол и отбирали изолированные колонии. Таким образом удалось получить 6 изолятов, устойчивых к толуолу в концентрации 150 мг/л. Они были исследованы на способность к деструкции в условиях непрерывного культивирования в аэробных условиях на минеральной среде М9. Выделенные 6 штаммов бактерий были обозначены под шифрами Тл 1, Тл 2, Тл 3, Тл 4, Тл 5 и Тл 6. При микроскопическом изучении данных видов бактерий установлено, что это мелкие грамотрицательные палочки бактерий, образующие на агаре мелкие, блестящие, гладкие, с однородной структурой, мягкой консистенцией, светлые выпуклые колонии с ровным краем.

Определение систематического положения отобранных штаммов проводится в соответствии с определителем бактерий Берги [13; 14; 15] по настоящее время. Анализ результатов, приведенных на рисунке 2, показывает, что в течение 4 суток произошло снижение концентрации толуола на 50%, затем рост культуры прекращался, в связи, с чем для эффективной работы консорциума необходимо проведение оптимизации условий биодеградации толуола [16; 17; 18].

Исследование изменений видового состава некоторых групп почвенных микроорганизмов чернозема выщелоченного, под влиянием формальдегида и толуола показало, что этот фактор вызывает изменения в комплексе почвенных микроорганизмов. Данный фактор выражается в снижении видового богатства и разнообразия и увеличении доли толерантных к загрязнению микроорганизмов.

Рисунок 2 – Деградация толуол при концентрации 100 мг/л штаммами Тл 1, Тл 2, Тл 3, Тл 4, Тл 5, Тл 6

Таким образом, полученные результаты показывают характер влияния различных доз формальдегида и толуола на состав и функционирование комплекса микроорганизмов почвы, а также вскрывают механизм воздействия химических веществ (формальдегиды и толуола) на почвенную микробиоту, связанный с ее устойчивостью и проявлением токсикоза почвы.