Rooting of Vaccinium corymbosum L. microshoots cv. «Blue-Berry» in culture in vitro and ex vitro

Full Text

Введение

Голубика высокорослая, имеющая высокое антиоксидантное действие, представляет собой особую ценность как пищевой продукт и лекарственное растительное сырье [1, с. 39–43; 2, с. 2714–2719; 3, с. 637–643; 4, с. 45–48]. Традиционно голубику размножают классическими методами вегетативного размножения, т.е. зелеными и одревесневшими черенками, а также отводками. Однако успешному применению этих методов препятствуют некоторые ограничения. Так, например, размножение черенками – относительно простой метод, но укоренение не всегда бывает удовлетворительным и часто требует применения регуляторов роста. Этот метод размножения трудоемок и требует значительной площади [1, с. 39–43; 3, с. 637–643; 5, с. 96–103; 6, p. 327–332].

В настоящее время получение в промышленных масштабах генетически однородного посадочного материала, сохраняющего свойства материнского растения, является одной из важных задач растениеводства. Использование современных биотехнологических подходов позволяет решить данную проблему, а метод клонального микроразмножения позволяет увеличить коэффициент размножения до сотен, тысяч и даже миллионов растений в год с одного растения. Микроклональное размножение считается альтернативным методом вегетативного размножения и является экономически выгодным [5, с. 96–103; 7, с. 5–9; 8, с. 104–107; 9, с. 286–288]. Кроме того, этот метод позволяет ускоренно размножать новые перспективные культуры, получать здоровый растительный материал, работать в лаборатории круглый год и планировать выпуск посадочного материала к определенному сроку [1, с. 39–43; 3, с. 637–643; 10, с. 37–39]. Важным этапом клонального микроразмножения является этап укоренения размноженных микропобегов in vitro, поскольку каждый вид и сорт растений предъявляет свои требования к условиям выращивания с их последующей адаптацией к естественным условиям среды.

Основной целью исследований являлось изучение эффективности влияния различных регуляторов роста на ризогенез Vaccinium corymbosum L. сорта Блю Берри в культуре in vitro и дальнейшей адаптации растений в условиях ex vitro.

Материал и методика исследований

Объектом для введения в культуру in vitro явились саженцы голубики высокорослой сорта Блю Берри полученные от компании Bekker в Казахстане. В качестве эксплантов использовали различные части растений – апикальные части стебля и сегменты стебля, взятые с саженцев (рис. 1).

Предварительная стерилизация первичных эксплантов проводилась путем промывания в мыльной воде, с последующей отмывкой стерильной водой. Обработка первичного растительного материала проводилась 15% раствором коммерческого отбеливателя «Белизна» (5,25% гипохлорида натрия NaOCl), с добавлением нескольких капель 0,1% «Твин-80» с экспозицией 10 и 15 минут.

 

Рисунок 1 – Типы эксплантов: А – сегменты стебля; Б – апикальные части стебля

 

После стерилизации экспланты были высажены на твердую базовую среду WPM [11, p. 421–427] с добавлением 1,0 мг/л зеатина (Зе) и 0,1 мг/л индолил-3-масляной кислоты (ИМК) [12, p. 40–44; 13, p. 233–240; 14, p. 294–304], 100 мг/л миоинозитола, 25 г/л сахарозы и 2,7 г/л фитагеля. Высаженные экспланты выращивались in vitro при искусственном освещении (3000 Люкс) в условиях фотопериода: 16/8 ч. свет/темнота и температуре воздуха 26 ± 2°C.

Микрочеренки, полученные на этапе собственно микроразмножения, в дальнейшем были перенесены на этап укоренения. В качестве индукторов ризогенеза были использованы ауксины: ИМК в концентрациях (0,5; 1,0; 2,0 мг/л) и β-индолилуксусная кислота (ИУК) в концентрациях 0,5 и 1,0 мг/л. Через десять недель культивирования были учтены следующие показатели: укоренившиеся экспланты (%), количество корней/эксплант (шт.), средняя длина корней (см).

Растения-регенеранты, имеющие развитую корневую систему, были перенесены в естественные условия ex vitro для адаптации. Экспланты, не имеющие корневой системы, были предварительно обработаны раствором ИМК в различных концентрациях (1,0 и 2,0 г/л) с экспозицией 5 и 10 минут и тоже перенесены в условия грунта.

Для адаптации растений-регенерантов голубики в качестве субстрата использовали почву (BONA FORTE, pH 3,5–4). Высаженные растения сверху накрывали пластиковыми колпачками и переносили в теплицу (температура 25 ± 1°C, относительная влажность 80–90%). Через 30 дней растения-регенеранты пересаживали в горшки большего размера – диаметром 12 см и выращивали на открытом воздухе. Период акклиматизации составлял 60–90 дней. Процент выживших растений-регенерантов регистрировали через 90 дней (рис. 2).

 

Рисунок 2 – Акклиматизированные растения- регенеранты голубики высокорослой сорта Блу Берри: A – имеющие развитую корневую систему; Б – не имеющие корневой системы

 

Результаты исследований и их обсуждение

Исследования показали, что использованный метод поверхностной стерилизации эксплантов оказался приемлемым и эффективным. При применении стерилизующего агента 10% раствора коммерческого отбеливателя «Белизна» (5,25% NaOCl) с экспозицией 10 минут выживаемость апикальной части стебля составила 90%. Наиболее высокие показатели выживаемости (100%) сегментов стебля асептической культуры голубики были получены при использовании метода стерилизации с применением 15% раствора отбеливателя «Белизна» в течение 15 минут.

Микропобеги, развившиеся в культуре, переносили на свежие питательные среды. Микроразмножение пазушных побегов голубики высокорослой было более эффективным на WPM с добавлением 1,0 мг/л Зе и 0,1 мг/л ИМК. Сегменты стебля с пазушными почками были использованы в последующих экспериментах. В течение пяти пассажей было показано, что максимальное увеличение количества здоровых пазушных побегов наблюдается на четвертом пассаже. Среднее количество пазушных побегов на эксплант составило 5,3 шт./эксплант со средней длиной 3,32 см. С пятого пассажа начинает появляться феномен гипергидратации (витрификации).

Важным этапом микроразмножения является укоренение полученных микрочеренков. Как известно, для эффективного укоренения микрочеренков в качестве индуктора ризогенеза применяют ауксин с подбором оптимальных его концентраций [15, с. 21–25]. Нами было изучено влияние различных ауксинов: ИМК в концентрациях 0,5; 1,0 и 2,0 мг/л; ИУК в концентрациях 0,5 и 1,0 мг/л и их комбинаций на укоренение полученных регенерантов V. corymbosum сорта Блю Берри в культуре in vitro.

Наиболее часто применяемым ауксином для стимуляции ризогенеза растений является ИМК. Он оказался наиболее эффективным для укоренения побегов таких культур, как Vaccinium corymbosum, Fragaria × ananasa, Grossularia и многих других [16, p. 144–146; 17, с. 22–30; 18, p. 169–176; 19, с. 25–28; 20, с. 246]. В результате наших исследований установлено, что присутствие в составе питательной среды 0,5 мг/л ИМК и 1,0 г/л активированного угля приводило к хорошему формированию корневой системы голубики высокорослой сорта Блю Берри через десять недель (рис. 3).

 

Рисунок 3 – Влияние ИМК (0,5 мг/л) на укоренение микрочеренков голубики сорта Блю Берри

 

На данной среде наблюдали наиболее высокие показатели (90%) укоренившихся эксплантов (рис. 4): количество корней/эксплант составило 4,4 шт. со средней длиной корней/эксплант 1,05 см по сравнению с контрольным вариантом (рис. 5).

 

Рисунок 4 – Укоренившиеся экспланты (%) V. corymbosum сорта Блю Берри на питательной среде WPM, дополненной различными концентрациями ауксина

 

Рисунок 5 – Влияние различных концентраций ауксина на укоренение микрочеренков голубики сорта Блю Берри через десять недель

 

В основе клонального микроразмножения растений лежат два принципиально разных этапа: in vitro и ex vitro. После переноса регенерантов из условий in vitro начинается второй этап жизнедеятельности регенерантов в системе ex vitro, то есть в условиях открытого грунта, совершенно отличных от условий in vitro. В условиях ex vitro растения вынуждены перейти с гетеротрофного типа питания на автотрофный. Важным этапом при получении размноженных растений-регенерантов является укоренение микропобегов in vitro. Слабо развитая корневая система в последующем отрицательно отражается на способности растений адаптироваться и выживать в условиях ex vitro. Как известно, в процессах индукции ризогенеза главная роль отводится эндогенному соотношению ауксинов [4, с. 45–48]. Для адаптации растений V. corymbosum полученные растения-регенеранты, имеющие развитую корневую систему, были перенесены в естественные условия ex vitro. Выход растений голубики высокорослой адаптированных к условиям выращивания ex vitro составил 100% (рис. 6, 7).

 

Рисунок 6 – Адаптация растений-регенерантов V. corymbosum сорта Блю Берри

 

Рисунок 7 – Влияние различных концентраций ауксина на выживаемость растений-регенерантов V. corymbosum сорта Блю Берри

 

Экспланты, не имеющие корневой системы, были предварительно обработаны ИМК в различных концентрациях (1,0 и 2,0 г/л) с экспозицией 0, 5 и 10 минут и тоже перенесены в условия грунта. Количество выживших растений-регенерантов (%) увеличилось с 60% (контрольный вариант) до 80% (обработанные варианты) (рис. 8).

 

Рисунок 8 – Влияние различных концентраций ИМК на выживаемость растений-регенерантов V. сorymbosum сорта Блю Берри, не имеющие корневой системы на этапе акклиматизации

 

Выводы

В результате наших исследований показана возможность укоренения микрочеренков Vaccinium corymbosum L. сорта Блю Берри в культуре in vitro и ex vitro. Для получения высокого коэффициента укоренения растений in vitro наиболее эффективным индуктором ризогенеза является ИМК в концентрации 0,5 мг/л, что позволяет укоренить до 90% микрочеренков голубики. Все растения-регенеранты, полученные in vitro, успешно проходят период адаптации к условиям выращивания ex vitro. У эксплантов, не имеющих корневой системы, показана возможность укоренения ex vitro после дополнительной обработки ИМК в концентрации 1 мг/л с экспозицией 5 минут, в результате чего 80% растений проходят укоренение. Таким образом, данное исследование представляет научный интерес и может использоваться в целях крупномасштабного производства Vaccinium corymbosum L.

About the authors

Gamil Abuo El-Dis Mohamed

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: gamil.rayan306@gmail.com

postgraduate student of Botany and Plant Physiology Department

Russian Federation, Kazan

Landysh Zavdetovna Khusnetdinova

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: husnetdinova.l@mail.ru

candidate of biological sciences, associate professor of Botany and Plant Physiology Department

Russian Federation, Kazan

Olga Arnoldovna Timofeeva

Kazan (Volga Region) Federal University

Author for correspondence.
Email: olga.timofeeva@kpfu.ru

doctor of biological sciences, professor of Botany and Plant Physiology Department

Russian Federation, Kazan

References

Supplementary files