Oil-oxidation properties of Micrococcus bacteria isolated from the Nakhodka Bay seawater of the Sea of Japan

Cover Page

Abstract

This paper shows the oil-oxidizing ability of Micrococcus bacteria isolated from the Nakhodka Bay surface waters of the Peter the Great Gulf, the Sea of Japan. Micrococcus Bacteria are known to be the most active destructors of petroleum hydrocarbons in natural biotopes, contaminated objects. Voroshilova-Dianova liquid containing 2,5% oil or oil products was introduced into sterile penicillin bottles with 105 cells of the investigated bacteria. The ability to destruct petroleum hydrocarbons by bacteria of this genus was studied using a gravimetric method during 30 days. Destruction of oil, gasoline, fuel oil and diesel fuel was shown. Micrococcus bacteria showed a high oil-oxidizing ability and decompose 65-99,9% of oil and oil products within 30 days. Gasoline was the source of petroleum hydrocarbons with the greatest ability to utilize this genus of bacteria. The destruction of this hydrocarbons source by bacteria on days 15-20 was about 99% of the initial concentration. The lowest ability of destruction by Micrococcus bacteria was revealed for diesel fuel.

Full Text

Актуальность исследований В прибрежных акваториях залива Петра Великого вблизи крупных городов вследствие выбросов неочищенных бытовых отходов и судоходства традиционно отмечается повышенное содержание нефти и нефтепродуктов [1-3]. Одним из наиболее перспективных способов ликвидации загрязнения морей является биоремедиация, представляющая собой совокупность методов очистки окружающей среды за счет биохимической активности различных живых объектов, в том числе морских микроорганизмов и микроорганизмов нефтяных залежей [4; 5]. Экологическое значение бактерий как разрушителей углеводородов нефти в море очень велико, так как известно, что более высокоорганизованные формы организмов не могут осуществлять их полную деструкцию. В прибрежной зоне, постоянно загрязняющейся нефтью и нефтепродуктами, формируются специфические сообщества гетеротрофных микроорганизмов, которые обладают способностью окислять широкий спектр углеводородов и продуктов их трансформации [6]. В настоящее время описано 70 родов углеводородоокисляющих микроорганизмов, из них 28 родов бактерий, 30 родов мицелиальных грибов и 12 родов дрожжей [7]. Бактерии рода Microccoccus известны как деструкторы нефтепродуктов в естественных биотопах загрязненных объектов [8]. Бухта Находка залива Петра Великого испытывает сильное нефтяное загрязнение [9-11]. В 2016 г. в бухте Находка в 70,8% проб концентрация нефтеуглеводородов была выше предельно допустимого значения [12]. К настоящему времени большинство микробиологических исследований бухты Находка рассматривают только сезонную изменчивость ОМЧ гетеротрофных бактерий, физиолого-трофических групп, в том числе нефтеокислящих бактерий [13; 14]. Таким образом, целью работы стало изучение нефтеокисляющих свойств бактерий рода Micrococcus, выделенных из бухты Находка Японского моря, утилизировать нефтеуглеводороды, такие как дизельное топливо, нефть, мазут и технический бензин. Материал и методы исследований Штаммы бактерий рода Micrococcus (Н1, Н2) были получены из проб морской воды бухты Находка залива Петра Великого (Японское море). Материалом для исследования послужили пробы поверхностных вод бухты, отобранные в августе 2015 г. (рис. 1). Пробы морской воды отбирались шприцем на глубине 15-20 см в пластиковый шприц (V = 20 мл) и обрабатывались в течение 3-6 часов. Посев проб воды производился методом последовательных разведений с высевом на поверхность среды Ворошиловой - Диановой с добавлением 2,5% нефти и нефтепродуктов [15; 16]. Инкубировали в течение 2 суток при комнатной температуре. Следующим этапом работы стало изучение фенотипических свойств полученных бактериальных изолятов. Морфологию клеток и колоний, подвижность, наличие спорообразования, физиолого-биохимические признаки, окраску по Граму, культуральные свойства учитывали в соответствии с классическими микробиологическими методами [17]. Идентификацию Micrococcus sp. проводили с помощью определителя Берджи [18]. Рисунок 1 - Карта-схема района исследования - бухта Находка Залива Петра Великого (Японское море) Для изучения углеводородокисляющей способности штаммов Micrococcus sp. Н1 и Н2 клетки бактерий в концентрации 105 КОЕ/мл инокулировали в стерильные пенициллиновые флаконы с жидкой средой Ворошиловой - Диановой с добавлением 2,5% нефти или нефтепродуктов [15; 16]. Для получения достоверных результатов учитывали процент естественных потерь нефтеуглеводородов за счет окисления, не связанных с деятельностью микроорганизмов. В качестве контроля была использована жидкая среда Ворошиловой - Диановой с добавлением 2,5% нефти или нефтепродуктов без добавления суспензии с микроорганизмами. Все опыты повторяли трижды. Изучение способности разлагать нефтеуглеводороды проводили c помощью гравиметрического метода в течение 30 суток [19]. Статистическую обработку проводили с использованием параметрических методов. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента [20]. Об изменении численности клеток бактерий судили по изменению оптической плотности опытных растворов. Измерения проводили при длине волны 540 нм на спектрофотометре UV-1800 SHIMADZU. Результаты исследований и их обсуждение Бактерии рода Micrococcus продемонстрировали высокую нефтеокисляющую способность, разложив 65-99% нефти и нефтепродуктов через 30 суток. Было показано, что источником нефтеуглеводородов с наибольшей способностью к утилизации исследуемыми бактериями являлся бензин. Деструкция данного нефтепродукта бактериями на 30 сутки составляла около 99% от начальной концентрации. Наименьшая способность разложения бактериями рода Micrococcus была выявлена для дизельного топлива. Скорость деструкции нефтеуглеводородов бактериями рода Micrococcus является штаммоспецифичной с сохранением высокой степени деструкции нефтеуглеводородов (табл. 1). Таблица 1 - Способность штаммов Micrococcus sp. (Н1, Н2) к окислению дизельного топлива, нефти, бензина и мазута на 30 сутки Вид субстрата Начальная концентрация субстрата, г/дм³ Н1 Н2 Конечная концентрация нефтепродукта, г/дм³ Степень деструкции, % Конечная концентрация нефтепродукта, г/дм³ Степень деструкции, % Нефть 21,98 ± 0,01 2,36 ± 0,01 89,26% 7,8 ± 0,01 65% Дизельное топливо 23,04 ± 0,02 4,68 ± 0,02 79,69% 2,58 ± 0,03 88,8% Мазут 34,46 ± 0,03 2,72 ± 0,04 92,11% 9,18 ± 0,02 73,3% Бензин 15,98 ± 0,01 0,14 ± 0,01 99,9% 0,02 ± 0,01 99,9% Примечание. Показатели M ± m; * различия статистически значимы по отношению к контролю (p < 0,05). Наиболее эффективно разложение бензина происходит в первые дни их взаимодействия с микроорганизмами рода Micrococcus. На 15-20-е сутки бактерии разложили бензин практически полностью, а дальнейший рост их численности обусловлен утилизацией продуктов распада нефтеуглеводородов (органических кислот, спиртов, альдегидов и т.п.) (табл. 2). Таблица 2 - Оптическая плотность штаммов Micrococcus sp. (Н1, Н2) и степень деструкции бензина на различные сутки эксперимента Сутки эксперимента Н1 Н2 Оптическая плотность бактерий Степень деструкции бензина (%) Оптическая плотность бактерий Степень деструкции бензина (%) 5 сутки 0,020 ± 0,003 98,25% 0,030 ± 0,006 75,00% 10 сутки 0,050 ± 0,002 98,87% 0,070 ± 0,004 83,73% 15 сутки 0,070 ± 0,004 98,87% 0,100 ± 0,003 99,50% 20 сутки 0,100 ± 0,003 99,00% 0,157 ± 0,004 99,62% 25 сутки 0,185 ± 0,001 99,9% 0,310 ± 0,007 99,9% 30 сутки 0,180 ± 0,002 99,9% 0,300 ± 0,001 99,9% Примечание. Показатели M ± m; * различия статистически значимы по отношению к контролю (p < 0,05). Выводы 1. Способность к деградации нефтеуглеводородов бактериями рода Micrococcus можно выстроить по степени утилизации: бензин > мазут > нефть > дизельное топливо. 2. Скорость деградации бензина бактериями рода Micrococcus является штаммоспецифичной.

×

About the authors

Julia Sergeevna Golozubova

Far Eastern Federal University

Author for correspondence.
Email: example@snv63.ru

postgraduate student of Ecology Department

Lyubov Stepanovna Buzoleva

Far Eastern Federal University

Email: example@snv63.ru

doctor of biological sciences, professor, professor of Biodiversity and Marine Bioresources Department

Elena Aleksandrovna Bogatyrenko

Far Eastern Federal University

Email: example@snv63.ru

candidate of biological sciences, associate professor of Biodiversity and Marine Bioresources Department

Alexandra Vyacheslavovna Kim

Far Eastern Federal University

Email: example@snv63.ru

postgraduate student of Ecology Department

Alena Igorevna Eskova

Far Eastern Federal University

Email: example@snv63.ru

postgraduate student of Biodiversity and Marine Bioresources Department

References

  1. Vashchenko M.A. Pollution in Peter the Great Bay, Sea of Japan, and its biological consequences // Russian Journal of Marine Biology. 2000. Vol. 26 (3). P. 155-166.
  2. Наумов Ю.А. Антропогенез и экологическое состояние геосистемы прибрежно-шельфовой зоны залива Петра Великого Японского моря. Владивосток: Дальнаука, 2006. 300 с.
  3. Ростов И.Д., Рудых Н.И., Ростов В.И., Воронцов А.А. Тенденции климатических и антропогенных изменений морской среды прибрежных районов России в Японском море за последние десятилетия // Известия ТИНРО. 2016. Т. 186. С. 163-181.
  4. Tan N.C.G., Prenafeta-Boldu F.X., Opsteeg J.L., Lettinga G., Field J.A. Biodegradation of azo dyes in co cultures of anaerobic granular sludge with aerobic aromatic amine degrading enrichment cultures // Appl. Microbial. Biotechnol. 1999. Vol. 51. P. 865-871.
  5. Миронов О.Г. Бактериальная трансформация нефтяных углеводородов в прибрежной зоне моря // Морской экологический журнал. 2002. Т. 1, № 1. С. 56-66.
  6. Wackett L.P. Biodegradation of fuel components // Environ. Microbiol. 2008. Vol. 10. P. 1380-1381.
  7. Иванов В.П., Сокольский А.Ф. Научные основы стратегии защиты биологических ресурсов Каспийского моря от нефтяного загрязнения. Астрахань: Изд-во КаспНИРХа, 2000. 181 с.
  8. Сазыкин И.С., Сазыкина М.Л., Чистяков В.А., Кленкин А.А., Павленко Л.Ф. Утилизация углеводородов, смол и асфальтенов нефтеокисляющими микроорганизмами керченского пролива // Вода: химия и экология. 2011. № 1. С. 29-34.
  9. Смолина (Макогина) И.С., Христофорова Н.К. Оценка качества морской воды заливов Восток и Находка // Географические и геоэкологические исследования на Дальнем Востоке. Вып. 2. Владивосток, 2006. С. 141-148.
  10. Галышева Ю.А. Биологические последствия органического загрязнения прибрежных морских экосистем российской части Японского моря // Известия ТИНРО. 2009. Т. 158. С. 209-227.
  11. Нигматулина Л.В., Кику Д.П., Черняев А.П. Оценка воздействия антропогенной деятельности на залив Находка (Залив Петра Великого, Японское море) // Известия ТИНРО. 2011. Т. 166. С. 219-230.
  12. Доклад об экологической ситуации в Приморском крае в 2016 году // Приморская газета. 2017. № 74 (1412). С. 6-29.
  13. Бузолева Л.С., Смирнова М.А., Безвербная И.П. Биологические свойства морских нефтеуглеводородокисляющих бактерий из прибрежных акваторий дальневосточных морей с разным характером загрязнения // Известия ТИНРО. 2008. Т. 155. С. 210-218.
  14. Бойченко Т.В. Химико-экологическая и микробиологическая оценка качества морских поверхностных вод Южного Приморья: дис. … канд. биол. наук. Владивосток, 2009. 150 с.
  15. Бузолева Л.С. Патент № 2520084 «Способ учета нефтеокисляющих бактерий в морской воде».
  16. Ворошилова А.А., Дианова Е.В. Окисляющие нефть бактерии - показатели интенсивности биологического окисления нефти в природных условиях // Микробиология. 1952. Т. ХХI, вып. 4. С. 408-415.
  17. Винникова О.И., Самойлов А.М., Попова Ю.В. Выделение и идентификация бактерий: методические рекомендации для студентов биологического факультета специализации «Микробиология и вирусология». Харьков: ХНУ имени В.Н. Каразина, 2011. 60 с.
  18. Хоулт Дж., Криг Н., Смит П. Определитель бактерий Берджи. В 2 т.: Т. 1, Т. 2. М.: Изд-во «Мир», 1997. 800 с.
  19. ПНДФ 14.1:2.116-97 Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в пробах природных и сточных вод методом колоночной хроматографии с гравиметрическим окончанием.
  20. Жижин К.С. Медицинская статистика: учебное пособие. Ростов-на-Дону: Феникс, 2007. 160 с.

Statistics

Views

Abstract: 104

PDF (Russian): 41

Dimensions

Article Metrics

Metrics Loading ...

PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2018 Golozubova J.S., Buzoleva L.S., Bogatyrenko E.A., Kim A.V., Eskova A.I.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies