Features of Melica virgata (Poaceae) seed germination in natural drought stress

Full Text

Введение

Особенности климатических условий на территории Восточного Забайкалья обусловили формирование специфического состава флоры региона. На распределение растений в фитоценозах оказывают влияние также микроклиматические условия. Так, неоднородность рельефа приводит к созданию разнообразных микроклиматических условий, которые выражаются в неравномерности распределения влаги, питательных веществ, в количестве солнечной радиации получаемыми склонами разной экспозиции и крутизны [1–3]. Эти особенности позволили сохраниться в составе растительного покрова узколокальным видам растений. Одним из таких растений является перловник прутьевидный Melica virgata Turcz. ex Trin. При семенном возобновлении важны адаптации, обеспечивающие устойчивость проростков на начальных этапах онтогенеза, так как условия произрастания характеризуются длительным дефицитом влаги и очень низкой влажностью воздуха в значительный период вегетации [4]. Одним из маркеров уровня сформированности адаптационных механизмов у растений является количественное и качественное изменение в составе тканей свободных аминокислот [5; 6]. Эта группа соединений выполняет множество функций в живых организмах, в том числе принимает участие в синтезе белков и пептидов, метаболизме азота, серы и многих микроэлементов, в энергетическом обмене, регуляции гомеостаза. Кроме того, аминокислоты и белки являются осмотически активными соединениями, градиент концентрации которых обеспечивает водный обмен и мембранный потенциал клеток живых организмов [7]. Изучение механизмов адаптаций, которые присутствуют у данного злака на ранних этапах онтогенеза, важно для разработки мер по сохранению этого редкого растения.

Цель исследования: изучить особенности адаптации M. virgata на начальных этапах онтогенеза к условиям физиологической засухи.

Объекты и методы

Объектом исследования был выбран перловник прутьевидный Melica virgata Turcz. ex Trin. Род Melica насчитывает около 80 видов, которые разделены на несколько секций, распространены главным образом в субтропических и умеренно теплых странах обоих полушарий, но отчасти также в горных районах тропиков [8; 9]. На территории бывшего СССР произрастает 17 видов преимущественно на лесных полянах, среди кустарников, на каменистых склонах и скалах. На территории Восточного Забайкалья встречаются два вида: Melica turczaninowiana Ohwi и M. virgata. M. virgata – многолетнее растение, образующее густые дерновины и произрастающее по каменистым степным склонам и их вершинам [8; 10]. Злак является узколокальным маньчжуро-даурским горностепным видом [11] и в Восточном Забайкалье пролегает северная граница его ареала. Относится к реликтам древнесредиземноморской (миоцен-плиоценовой) флоры [12]. В Забайкальском крае отмечался в окрест. сс. Кыра, Акша, Усть-Иля [10; 13], а также в заказнике «Горная степь» и в Могойтуйском районе. Также вид отмечен в Красночикойском районе по прогреваемым склонам в глубоких межгорных депрессиях [14; 15]. Изучение этих фитоценозов показало, что они отличаются уникальным видовым составом, включают редкие, эндемичные и реликтовые виды, которые смогли сохраниться на ограниченных территориях долины реки Чикой [16]. M. virgata включен в Красную книгу Забайкальского края, категория статуса 1 (находящиеся под угрозой исчезновения) [13].

Семена злака для исследований были собраны в популяции в Красночикойском районе. После подготовки семян [17] помещали семена в чашки Петри на фильтровальную бумагу, добавляли дистиллированную воду (контроль) или раствор осмотика и проращивали в термостате при температуре +21°C в течение 10 дней. Осмотический стресс разной силы (р_осм. = 3, 5, 7, 10, 13, 15 и 18 атм.) создавали раствором маннита в дистиллированной воде [18]. Метод позволяет на ранних этапах онтогенеза определить относительную засухоустойчивость различных видов растений. Ежедневно подсчитывали количество проросших семян. Для оценки влияния физиологической засухи на рост проростков использовали морфометрические исследования, для этого измеряли длину листовых пластинок проростков и рассчитывали среднюю длину и ошибку среднего. Аналогичные расчеты были проведены и для корня.

Для оценки использования проростком растворимых фракций запасных белков определили содержание четырех фракций (альбумины, глобулины, проламины, глютелины) в сухих семенах и при прорастании [6]. Концентрацию белковых фракций определяли фотометрически по методу Lowry при λ = 626 нм (фотометр «Эксперт 003»).

Для изучения воздействия осмотического стресса на динамику свободных аминокислот в проростках контрольную группу зерновок проращивали на фильтровальной бумаге, смоченной дистиллированной водой, а опытные – в присутствии осмотика (маннит, р_осм. = 5 атм.). Количественное содержание свободных аминокислот определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии [19]. В ходе исследования определяли содержание 20 аминокислот (18 протеиногенных (кроме пролина и цистеина) и 2 непротеиногенные – таурин и орнитин) в сухих и прорастающих семенах злака в контроле и при осмотическом стрессе [20]. Полученные данные были подвергнуты статистической обработке методами описательной статистики (MS Excel 2010, PAST 3.0).

Результаты и их обсуждение

В ходе проведения эксперимента изучено прорастание семян M. virgata в условиях осмотического стресса, результаты представлены на рис. 1. Наибольшее значение всхожести семян отмечено в условиях контроля и при небольшом уровне осмотического стресса (3, 5 и 7 атм.), всхожесть 95–97%. Присутствие в среде осмотика замедляет скорость прорастания. Так, если в контроле и при 3 атм. всхожесть достигла своего максимума уже на третьи сутки, то при 5 атм. и 7 атм. – на седьмые сутки. Дальнейшее увеличение осмотического давления привело к снижению как скорости прорастания, так и проценту всхожести. Если при 10 и 13 атм. семена к концу проведения опыта имели средние показатели всхожести (80 и 70% соответственно), то при 15 и 18 атм. – только 30 и 10%. Осмотический стресс влияет на рост вегетативных органов, поэтому в ходе эксперимента определяли морфометрические показатели проростков (рис. 2 и 3). Значительное угнетение ростовых процессов отмечено при осмотическом давлении в 13, 15 и 18 атм. Высокая концентрация осмотика практически полностью останавливает ростовые процессы. На десятые сутки при 18 атм. средняя длина листовой пластинки и корня составила 2 и 1 мм соответственно.

 

Рисунок 1 – Динамика прорастания семян M. virgata в условиях осмотического стресса

 

Рисунок 2 – Динамика средней длины листа проростков M. virgata в условиях осмотического стресса

 

Рисунок 3 – Динамика средней длины корня проростков M. virgata в условиях осмотического стресса

 

Результаты определения фракций запасных белков в семенах M. virgatа представлены в табл. 1. Белковость семян M. virgatа достигает 100,01 мг/г сырой массы. Преобладающей фракцией в белковом комплексе этого злака являются глютелины (68,33 мг/г сырой массы). Особый интерес представляет определение количества проламинов в семенах исследуемых злаков, так как синтез этих адаптивных белков для злаков считается уникальной физиолого-биохимической особенностью [21]. Для развивающегося проростка злаков проламины выполняют функцию быстро реализуемого (в течение 4–6 суток) запаса аминокислот и азота [22; 23]. Концентрация проламинов в семенах M. virgatа оказалась значительной (22,77 мг/г сырой массы), а концентрация альбуминов и глобулинов небольшой (3,67 и 5,24 мг/г сырой массы соответственно). Результаты определения концентрации белковых фракций при прорастании семян M. virgatа показали, что в течение первых суток начинается процесс мобилизации белков, хотя видимого прорастания еще не отмечается. Расходуются все фракции белков, особенно велик вклад в запуск ростовых процессов проламинов (концентрация уменьшилась в 2 раза) и глютелинов (концентрация уменьшилась в 1,6 раз). Далее концентрации этих двух фракций продолжили снижаться, к седьмым суткам проращивания проламины почти израсходовались. Начиная со вторых суток проращивания, концентрация альбуминов и глобулинов начинает возрастать. Это свидетельствует о синтетических процессах, происходящих в проростке. Видимое прорастание семян этого злака начинается на третьи сутки, с этого момента отмечается значительный рост количества альбуминов и глобулинов.

 

Таблица 1 – Динамика фракций растворимых белков в семенах Melica virgata при прорастании, мг/г сырого веса

	Альбумины	Глобулины	Проламины	Глютелины
Сухие семена	3,67 ± 0,03	5,24 ± 0,03	22,77 ± 0,1	68,33 ± 0,3
1 сутки	1,75 ± 0,02	3,21 ± 0,01	10,52 ± 0,02	42,34 ± 0,03
2 сутки	5,38 ± 0,01	4,71 ± 0,02	10,23 ± 0,03	37,56 ± 0,2
3 сутки	7,23 ± 0,04	7,63 ± 0,05	9,91 ± 0,1	24,57 ± 0,05
7 сутки	13,58 ± 0,03	10,32 ± 0,04	2,81 ± 0,01	10,54 ± 0,3

 

Помимо мобилизации запасных белков при прорастании семян проанализировали динамику свободных аминокислот (табл. 2). Поскольку в литературе имеются данные об изменении общего количества свободных аминокислот при действии стрессоров различной природы, то проанализируем сначала изменение суммы свободных аминокислот в условиях осмотического стресса по сравнению с контролем. При анализе полученных данных было выявлено значительное отличие в суммарном содержании свободных аминокислот в зависимости от действия осмотического стресса. По сравнению с количеством свободных аминокислот в сухих семенах M. virgatа наблюдается значительное увеличение их концентрации в течение первых суток проращивания (и в контроле, и при осмотическом стрессе 5 атм. в 23,5 раза). Такое увеличение концентрации свободных аминокислот (в контроле 7739, при 5 атм. – 7754,41 мкг/г сырой массы) можно объяснить гидролизом резервных белков. В условиях действия осмотика на вторые сутки произошло еще небольшое выделение свободных аминокислот, в контроле же наблюдалось уменьшение концентрации в 2 раза. Образующиеся в первые сутки свободные аминокислоты включаются в синтез полипептидов, необходимых для процесса прорастания, и, как показало исследование, начало видимого прорастания (3 сутки) в контроле и при 5 атм. характеризуется снижением концентрации свободных аминокислот. Несмотря на тенденцию к снижению количества свободных аминокислот к третьим суткам, концентрация их в условиях осмотического стресса больше чем в контроле в 1,6 раз. Таким образом, обнаружено заметное увеличение пула свободных аминокислот в первые сутки проращивания семян M. virgatа, особенно в растворе с осмотическим давлением 5 атм. Вероятно, одной из причин наблюдаемых явлений служит создание более высокое значение осмотического давления в зерновках для притока воды и активации процессов прорастания.

Кислые аминокислоты (асп, глу) и их амиды (глн, асн) в первые сутки проращивания и в контроле и при 5 атм. показали значительный рост концентрации (табл. 2). Так, содержание асп по сравнению с сухими семенами увеличивалось в 29 раз (1 сутки), еще значительнее в растворе осмотика – более чем в 60 раз. Далее содержание этой аминокислоты будет уменьшаться, однако на вторые и третьи сутки имело схожие значения. Динамика глу была сходной. В первые сутки резко увеличивалась концентрация этой аминокислоты (в 29 и 56 раз соответственно). В дальнейшем происходило 2-кратное снижение количества с постепенным уменьшением концентрации к третьим суткам от момента начала прорастания. Количество асн и глн в первые сутки увеличивалось, однако в контроле количество асн уменьшалось, тогда как в растворе осмотика оставалось достоверно выше. Напротив, глн имел высокие цифры в контроле, а в растворе маннита значительно уменьшалась его концентрация.

 

Таблица 2 – Содержание свободных аминокислот в сухих семенах и проростках M. virgata, мкг/г сырой массы

Аминокислоты	Сухие семена	Контроль			5 атм.
		1 сут.	2 сут.	3 сут.	1 сут.	2 сут.	3 сут.
Асп	7,90	232	92,79	92,81	494,19	302,07	269,24
Глу	27,70	827	330,84	200,37	1555,84	844,73	546,61
Асн	23,10	533	213,20	263,61	1206,70	1060,41	487,34
Глн	63,80	1718	686,87	1545,73	698,29	365,29	52,42
Сер	29,25	698	279,15	146,50	441,25	846,91	68,30
Гли	23,98	633	253,23	147,88	903,03	653,42	89,90
Тре	8,70	162	65,11	60,76	172,03	189,68	144,53
Ала	29,35	749	299,73	41,58	20,70	685,27	89,87
Гис	12,05	334	133,75	84,07	402,62	306,19	2316,15
Лиз	4,93	152	60,78	25,79	90,07	171,06	127,54
Арг	6,38	165	66,32	18,75	73,50	192,33	29,24
Фен	8,54	149	59,87	143,31	382,73	222,96	229,58
Тир	12,05	203	81,23	98,26	142,72	347,53	155,38
Трф	6,14	162	64,83	95,50	145,82	206,28	229,44
Вал	18,38	382	152,73	15,99	245,98	2,14	260,02
Иле	8,20	209	83,78	110,81	190,42	219,32	147,39
Лей	16,07	365	146,25	107,52	260,18	410,13	150,62
Мет	2,78	28	11,32	73,25	83,27	563,79	70,71
Орнитин	2,97	38	19,30	64,70	132,57	74,79	29,27
Таурин	17,80	8	385,82	10,95	112,50	251,71	15,24
Сумма свободных аминокислот	329,50	7739	3486,92	3348,14	7754,41	7916,00	5508,79

 

Динамика основных аминокислот имела следующие особенности: в контроле максимальное количество всех аминокислот группы резко возрастало в первые сутки и в дальнейшие этапы прорастания имело тенденцию к снижению их содержания. В растворе осмотика, напротив, происходило значительное увеличение содержания гис к третьим суткам от начала эксперимента, тогда как содержание лиз и арг имело более скромный рост до вторых суток, в дальнейшем снижаясь. Содержание ароматических аминокислот в контроле имело максимальные концентрации в первые сутки прорастания, ко вторым суткам происходило их 2-кратное уменьшение, и вновь наблюдался рост к третьим суткам. В эксперименте прирост был существеннее (особенно по содержанию фен в 1 сутки – в 45 раз, в контроле – в 17,5 раз по сравнению с сухими зерновками). Рост концентрации аминокислот шикиматного пути (тир и фен), использующихся для синтеза веществ с антиоксидантными свойствами, может защищать проростки от воздействия свободных радикалов. В последующие периоды содержание фен уменьшилось, а тир и три, напротив, увеличивали свое содержание.

Непротеиногенные аминокислоты имели следующие тенденции в динамике: содержание орнитина в контроле постепенно увеличивалось к третьим суткам от начала эксперимента. Следует отметить значительное увеличение концентрации орнитина в условиях осмотического стресса, в первые сутки концентрация увеличивается в 44,6 раз. Ко вторым суткам содержание орнитина уменьшается наполовину, и далее к третьим суткам происходит значительное уменьшение. Количество таурина максимальных цифр достигало на момент вторых суток и в контроле, и в растворе осмотика. Однако далее его содержание вновь уменьшалось до уровня сухих зерновок.

Заключение

Изучение прорастания зерновок M. virgata в условиях физиологической засухи показало, что вид хорошо приспособлен к подобным условиям и имеет возможности для интенсификации ростовых процессов до высоких значений осмотического давления (до 13 атм.). Но в таких условиях даже эуксерофиты испытывают значительные трудности на этапе прорастания [24]. Поэтому, судя по полученным данным, можно говорить о высоком адаптивном потенциале изучаемого злака к условиям физиологической засухи на начальных этапах онтогенеза. Этот потенциал может быть связан с повышением уровня свободных аминокислот в условиях физиологической засухи, которые могут способствовать улучшению поступления воды в семя и защите от окислительного стресса.

About the authors

Irina Nikolaevna Plyaskina

Chita State Medical Academy

Email: thebestdamnthing@mail.ru

assistant of Biology Department

Russian Federation, Chita

Evgeniy Aleksandrovich Bondarevich

Chita State Medical Academy

Email: bondarevich84@mail.ru

candidate of biological sciences, associate professor of Chemistry and Biochemistry Department

Russian Federation, Chita

Nataliya Petrovna Larina

Chita State Medical Academy

Email: nat15398723@yandex.ru

candidate of biological sciences, head of Biology Department

Russian Federation, Chita

Nataliya Sergeevna Chistyakova

Chita State Medical Academy

Author for correspondence.
Email: chistyacovans@mail.ru

candidate of biological sciences, associate professor of Biology Department

Russian Federation, Chita

References

Supplementary files