Analysis of benzotriazole influence on some morphological and physiological characteristics of Allium fistulosum

Cover Page

Abstract


The increase in anthropogenic pressure has led to the need for model experiments to assess the ability of organisms to adapt to xenobiotics. The study of negative effects is usually carried out in laboratories using animals as test objects, while it is more interesting to study tolerance and adaptive capabilities in plant organisms, because, unlike animals, they are not able to leave an area uncomfortable for existence. In order to obtain an objective response in experiments, it is necessary to choose test objects related to species that are ubiquitous in ecosystems, and xenobiotics that are widely used and able to enter the environment. Allium fistulosum L. was used in model experiments and was affected by benzotriazole to study the possibility of developing an adaptive response in plants to anthropogenic pollutants. Plants were preadapted to a toxic dose of benzotriazole at a concentration of 0,1 mg/ml, by exposure to alcohol solutions of benzotriazole at a concentration of 0,0001 mg/ml or 0,001 mg/ml, and the time of preliminary exposure varied from 1 day to 4 days, then test objects germinated in a solution of high concentration. There were three controls, where the seeds were germinated for five days in all three used concentrations of benzotriazole, as well as in a solvent, which was 0,5% isopropyl alcohol. The possibility of adaptive response was assessed using two morphophysiological indicators, these were the germination of seeds and the average root length on the fifth day of the experiment. Experiments have shown that a solution of benzotriazole at a concentration of 0,1 mg/ml inhibits seeds germination and roots growth compared with the control (germination in 0,5% isopropyl alcohol), while at a concentration of 0,0001 mg/ml it stimulates. Exposure to low concentrations reliably creates a preadaptation to the toxic dose, but the responses significantly differ in effectiveness depending on the duration of preadaptation and the concentration of the substance. The greatest effect on the toxic effect of benzotriazole is created by preadaptation in low concentrations over 3 days. Possible preadaptation mechanisms are discussed.

Full Text

Введение Загрязнение биосферы антропогенными ксенобиотиками с каждым годом увеличивается, что приводит как к распространению толерантных к поллютантам видов растений, так и к исчезновению высокочувствительных видов. Возник закономерный интерес к раскрытию механизмов устойчивости видов к ингибирующему воздействию токсикантов. В этом плане, как правило, исследуются виды-индикаторы, но, очевидно, необходимо исследовать также виды, которые повсеместно распространены в самых различных экосистемах, в частности представители рода Allium. Род Allium L. (сем. Amaryllidaceae) - один из крупнейших родов однодольных растений, включающий ряд овощных культур. По объему производства наиболее экономически значимыми представителями рода являются лук репчатый (A. cepa), чеснок (A. sativum) и лук-порей (A. porrum) [1, с. 4]. Представители этого рода рекомендованы ВОЗ для анализа генотоксичности антропогенных ксенобиотиков [2, с. 86-97]. Для видов рода Allium наиболее характерны патиентная и рудеральная составляющие стратегии жизни. Выживание видов (сохранение в составе фитоценоза) в неблагоприятных эколого-фитоценотических условиях чаще всего наиболее эффективно обеспечивают адаптивные механизмы патиентной (нишевой) составляющей стратегии жизни [3, с. 93-109; 4, с. 68-73]. Именно поэтому целесообразно в модельных экспериментах использовать представителей этого рода. Когда в экотоксикологии ставятся модельные эксперименты по анализу биологических ответов изучаемых тест-объектов, необходимо использовать широко и давно применяемые ксенобиотики. Бензотриазол относится к таким ксенобиотикам. Он используется в фармакологической промышленности для синтеза новых лекарственных препаратов [5, с. 375-385], в металлургии в качестве ингибиторов коррозии [6], в химической промышленности в различных синтезах [7, с. 409-548] и как супрамолекулярные лиганды [8, с. 2515-2522]. Бензотриазол и его производные обнаруживаются в окружающей среде [9, p. 73-80; 10, p. 105-110]. Все вышесказанное делает его очень перспективным модельным поллютантом в экспериментах. Целью исследования был анализ реакций Allium fistulosm L. на организменном уровне (всхожесть семян, рост корней) под действием спиртовых растворов бензотриазола в различных вариациях. Материалы и методы Объект исследования - A. fistulosm L. сорта Русский Зимний. Анализировали токсичность спиртовых растворов бензотриазола в концентрациях 0,0001; 0,001; 0,1 мг/мл. Растворителем служил 0,5% изопропиловый спирт. Одновременно было поставлено 12 серий экспериментов. В каждой серии семена лука помещали на фильтровальную бумагу в чашки Петри, пропитанную исследуемыми растворами в избранной концентрации по 20 штук в каждую. Таким образом, для каждой серии исследовали 60 семян. 1 серия. Семена в течение 5 суток проращивали в 0,5% растворе изопропилового спирта. 2 серия. Семена в течение 5 суток проращивали в спиртовом растворе бензотриазола в концентрации 0,0001 мг/мл. 3 серия. Семена в течение 5 суток проращивали в бензотриазоле в концентрации 0,001 мг/мл. 4 серия. 60 семян в течение 5 суток проращивали в бензотриазоле в концентрации 0,1 мг/мл. 5 серия. Семена проращивали в течение 1 суток в растворе бензотриазола 0,0001 мг/мл, затем переносили в чашки Петри с бензотриазолом в концентрации 0,1 мг/мл, где проращивались еще 4 суток. 6 серия. Семена проращивали 2-е суток в растворе бензотриазола 0,0001 мг/мл, затем растения переносили в чашки Петри с бензотриазолом в концентрации 0,1 мг/мл, где растения росли еще 3-е суток. 7 серия. Семена проращивали 3-е суток в растворе бензотриазола 0,0001 мг/мл, затем переносили в чашки Петри с бензотриазолом в концентрации 0,1 мг/мл, где растения росли еще 2-е суток. 8 серия. Семена проращивали в течение 4 суток в растворе бензотриазола 0,0001 мг/мл, затем переносили в чашки Петри с бензотриазолом в концентрации 0,1 мг/мл, где растения росли еще 1 сутки. 9 серия. Семена проращивали в течение 1 суток в растворе бензотриазола 0,001 мг/мл, затем переносили в чашки Петри с бензотриазолом в концентрации 0,1 мг/мл, где растения росли еще 4 суток. 10 серия. Семена проращивали в течение 2-х суток в растворе бензотриазола 0,001 мг/мл, затем переносили в чашки Петри с бензотриазолом в концентрации 0,1 мг/мл, где растения росли еще 3-е суток. 11 серия. Семена проращивали в течение 3-х суток в растворе бензотриазола 0,001 мг/мл, затем переносили в чашки Петри с бензотриазолом в концентрации 0,1 мг/мл, где растения росли еще 2-е суток. 12 серия. Семена проращивали в течение 4 суток в растворе бензотриазола 0,001 мг/мл, затем переносили в чашки Петри с бензотриазолом в концентрации 0,1 мг/мл, где растения росли еще 1 сутки. Подсчитывали всхожесть семян в процентах и среднюю длину корней на 5-й день роста. Достоверность различий между сериями экспериментов рассчитывали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа [11, с. 155-208]. Результаты и обсуждение Растения, в отличие от животных, не способны активно избегать чужеродных соединений и поэтому вырабатывают стратегии выживания, позволяющие справиться с токсическим воздействием, развивая адаптивный ответ. Это один из широко известных эффектов малых доз, проявляющийся в том, что предварительное воздействие на клетки или организмы повреждающего агента в малых дозах увеличивает их устойчивость к повторному воздействию этого же, а иногда и другого агента в больших дозах [12, с. 59-67]. Мы поставили ряд серий экспериментов, где кратковременно воздействовали на лук низким дозами раствора бензотриазола, а потом переносили растения на высокую дозу 0,1 мг/мл этого же соединения. Исследовали две очень низкие дозы, а в качестве доказательств адаптивного ответа исследовали такие параметры, как всхожесть и длину корней. Чтобы оценить адаптивный ответ, результаты сравнивали с сериями экспериментов, в которых растения росли в течение пяти суток либо в трех исследованных концентрациях, либо в растворителе. На рис. 1 представлены суммированные результаты экспериментов по выяснению возможности создания преадаптации растений к токсичной дозе бензотриазола в концентрации 0,1 мг/мл его же низкими дозами. Биологический ответ оценивали по такому физиологическому показателю, как всхожесть, подсчитывая изменение прорастания семян в различных сериях эксперимента. Рисунок 1 - Влияние на всхожесть семян A. fistulosum бензотриазолом в разных концентрациях в различных сочетаниях (первая цифра в обозначениях на оси ординат говорит о длительности предварительного воздействия, «+» показывает длительность последующего воздействия высокой дозой) Как видно из представленных результатов, преадаптация низкой дозой в течение суток оказывается недостаточной для развития адаптивного ответа, и процент проросших семян не отличается от такового при действии бензотразола в концентрации 0,1 мг/мл в течение 5 суток. Преадаптация в течение двух суток обеими низкими концентрациями вызвала адаптивный ответ, но эффективнее была преадаптация концентрацией 0,0001 мг/мл, так как процент проросших семян не отличался от такового в контроле, когда семена проращивали в 0,5% изопропиловом спирте. Проращивание растений в течение 5 суток на растворе бензотриазола в концентрации 0,0001 мг/мл показало стимулирующий эффект, так как число проросших семян было выше, чем в растворителе - изопропиловом спирте, то есть мы явно имеем дело с гормезисом. Обычно при исследовании феномена гормезиса используют животных, и работ, проводимых на растениях, немного, но в последние годы возрос интерес к этому явлению. Были выявлены в реакциях древесных растений, используемых в качестве индикаторов, парадоксальные ответы на загрязнение окружающей среды автомобильными выхлопами, когда невысокие дозы стимулировали некоторые физиологические процессы [13, с. 432-437; 14, с. 396-398; 15, с. 76-78]. Было показано, что предпосевное γ-облучение семян ячменя влияет на развитие растений в течение всего вегетационного периода, стимулируя хозяйственно ценные признаки. Конкретная реализация эффекта гормезиса зависела от факторов среды, в которой происходило развитие растений [16, с. 823-826]. Наблюдаемые в области малых доз биологические эффекты обусловлены особенностями реализации ответной реакции клетки и организма, являющиеся результатом развертывания во времени генетической программы, выбор конкретного варианта которой определяется интенсивностью и характером внешнего воздействия. В нашем случае это длительность воздействия. Преадаптация в течение 3-х суток в обоих растворах низкой концентрации с последующим переносом растений в раствор бензотриазола с высокой концентрацией давало им возможность развить адаптивный ответ. Такой результат позволяет заключить, что именно при трехсуточной длительности создания преадаптации следует изучать механизмы этого процесса. Проведенный двухфакторный дисперсионный анализ показал, что преадаптации разными дозами достоверно отличаются друг от друга (p < 0,050), а длительность преадаптации является важным фактором для развития адаптивного ответа (p < 0,02). Всхожесть семян - это интегральный физиологический показатель состояния растения, зависящий от многих показателей: целостности семенной кожуры, веса семени, влажности и т.п. Поэтому необходимо исследование адаптивного ответа, являющегося частным случаем гормезиса, на более конкретные параметры состояния растения, например рост корней лука. Многие исследователи используют корни как тест-объекты анализа биологического действия токсикантов [17, с. 944-952], поэтому мы измеряли среднюю длину корней во всех сериях экспериментов и сравнивали полученные результаты между собой с целью выявления способности у низких доз бензотриазола создать преадаптации к токсическому действию его высокой дозы (0,1 мг/мл) для ростовых процессов. Результаты проведенных экспериментов показаны на рис. 2. Рисунок 2 - Влияние на среднюю длину корней A. fistulosum бензотриазолом разных концентраций в различных сочетаниях (первая цифра в подписи на оси ординат говорит о времени предварительного воздействия, «+» показывает последующее воздействие и длительность высокой дозой) Известно, что у растений переход в состояние стресса на организменном уровне заключается в интеграции сигналов на уровне апикальных меристем и усилении их формообразовательных и акцепторных свойств [18, с. 6]. Рост корней является суммарным итогом нескольких процессов: митотической активности в клетках корневой меристемы, процессов, идущих в зоне растяжения и т.д. Именно поэтому на этом уровне адаптивный ответ будет очень выраженным. Преадаптация низкими дозами для роста корней, выявленная для всхожести семян, имеет те же закономерности. Проведенный двухфакторный дисперсионный анализ показал, что на развитие адаптивного ответа, выражающегося в стимуляции ростовых процессов, достоверно влияет и концентрация нетоксических доз (p < 0,01), и продолжительность их воздействия (p < 0,02). Наиболее ярко адаптивный ответ наблюдается при воздействии низкими дозами в течение трех суток. Из представленных результатов видно, что при этой длительности воздействия обе концентрации дают сходный ответ. По-видимому, высокая концентрация бензотриазола, выбранная нами, активирует защитные системы поддержания параметров гомеостаза, необходимые для выживания. При более низких концентрациях наблюдается «переключение» механизмов, обеспечивающих более тонкую регуляцию состояния организма, в результате чего наблюдается адаптивный ответ. Сходные процессы выявлены при радиационном гормезисе [19, с. 406-411; 20, с. 77-80]. Возможно, что за счет механизмов сверхкомпенсации явление гормезиса чаще будет наблюдаться у высокотолерантных к антропогенным ксенобиотикам растений. Выводы 1. Выявлена способность низких концентраций бензотриазола вызывать адаптивный ответ у A. fistulosum проявляющийся как в показателях всхожести семян, так и ростовых процессах - средней длине корней тест-объекта. 2. Доказано, что оптимальное время для создания преадаптации к токсическому действию бензотриазола является воздействие низкими дозами в течение трех суток. 3. Обнаружено явление гормезиса при воздействии на A. fistulosum дозой бензотриазола в концентрации 0,0001 мг/мл.

About the authors

Ekaterina Sergeevna Selezneva

Samara National Research University


candidate of biological sciences, associate professor of Zoology, Genetics and General Ecology Department

References

  1. Филюшин М.А. Анализ полиморфизма геномов Allium sativum и родственных видов секции Allium: автореф дис. … канд. биол. наук. М., 2017. 20 с.
  2. Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических соединений. Гигиенические критерии окружающей среды. № 51. Женева: ВОЗ, 1982. 212 с.
  3. Чадаева В.А., Шхагапсоев С.Х. Анализ стратегий выживания видов рода Allium L. российской части Кавказа // Юг России: экология, развитие. 2016. Т. 11, № 4. С. 93-109.
  4. Чадаева В.А. Биоиндикационное значение и роль видов рода Allium L. (Alliaceae) в поддержании устойчивости экосистем // Ботанический вестник Северного Кавказа. 2016. № 2. С. 68-73.
  5. Suma B.V., Natesh N.N., Madhavan V. The benzotriazole in medicinal chemistry: a review // Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 2011. Vol. 3. P. 375-381.
  6. Агафонкина М.О. Ингибирование коррозии черных и цветных металлов в нейтральных средах 1, 2, 3-бензотриазолом и его композициями с солями карбоновых кислот: автореф. дис. … канд. хим. наук. М., 2011. 20 с.
  7. Katritzky A.R., Lan X., Yang J.Z., Denisko O.V. Properties and synthetic utility of N-substituted benzotriazolides // Chemical Reviews. 1998. Vol. 98, № 2. P. 409-548.
  8. Wang L., Zhao L., Xue R.Y., Lu X.F., Wen Y.H. et al. Construction of interesting organic supramolecular structures with synthon interaction in 1H-benzotriazole and hydroxybenzoic acid crystals // Science China Chemistry. 2012. Vol. 55. P. 2515-2522.
  9. Nukaya H., Shiozawa T., Tada A., Terao Y., Ohe T., Watanabe T., Takahashi Y., Asanoma M., Sawanishi H., Katsuhara T., Sugimura T., Wakabayashi K. Identification of 2-[2-(acetylamino)-4-amino-5-methoxyphenyl]-5-amino-7-bromo-4-chloro-2H-benzotriazole (PBTA-4) as a potent mutagen in river water in Kyoto and Aichi prefectures, Japan // Mutat. Res. 2001. Vol. 492. P. 73-80.
  10. Shiozawa T., Suyama K., Nakano K., Nukaya H., Sawanishi H., Oguri A., Wakabayashi K., Terao Y. Mutagenic activity of 2-phenylbenzotriazole derivatives related to a mutagen, PBTA-1, in river water // Mutat. Res. 1999. Vol. 442 (2). P. 105-110.
  11. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. 352 с.
  12. Горшкова Т.А. Некоторые закономерности адаптивного ответа растущих популяций Saccharomyces cerevisiae на действие ионизирующего излучения // Радиация и риск. 2006. Т. 15, № 1-2. С. 59-67.
  13. Жуйкова Т.В., Безель В.С., Позолотина В.Н., Северюхина О.А. Репродуктивные возможности растений в градиенте химического загрязнения среды // Экология. 2002. № 6. С. 432-437.
  14. Ерофеева Е.А. Глубина зимнего покоя и скорость выхода из него березы повислой в биотопах с различным уровнем автотранспортного загрязнения // Вестник ННГУ им. Н.И. Лобачевского. 2010. № 2 (2). С. 396-398.
  15. Ерофеева Е.А. Влияние автотранспортного загрязнения на скорость выхода из состояния зимнего покоя и окончание вегетации у липы мелколистной // Вестник ННГУ им. Н.И. Лобачевского. 2011. № 2 (2). С. 76-78.
  16. Чурюкин Р.С., Гераськин С.А. Проявление эффекта гормезиса у растений ячменя (Hordeum vulgare L.) в контрастных условиях произрастания при γ-облучении семян // Сельскохозяйственная биология. 2017. Т. 52, № 4. С. 820-829.
  17. Иванов В.Б. Использование корней как тест-объектов для оценки биологического действия химических соединений // Физиология растений. 2011. Т. 58, № 6. С. 944-952.
  18. Нефедьева Е.Э. Физиолого-биохимические процессы и морфогенез у растений после действия импульсного давления на семена: автореф. дис. … д-ра биол. наук. М., 2011. 45 с.
  19. Литвинов С.В. Влияние хронического облучения семян и проростков Aradobsis thaliana малыми дозами γ-радиации на рост и развитие растений // Ядерная физика и энергетика. 2014. Т. 15, № 4. С. 406-414.
  20. Филиппова Г.В., Ксенофонтова К.И. Влияние предпосевного γ-облучения семян костреца безостого (Bromopsis inermis Leyss.) и люцерны серповидной (Medicago falcate L.) на выживаемость в условиях высокой щелочности почв Центральной Якутии // Наука и образование. 2009. № 2. С. 77-80.

Statistics

Views

Abstract - 54

PDF (Russian) - 12

Cited-By


PlumX

Dimensions

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2019 Selezneva E.S.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies