Analysis of benzotriazole influence on some morphological and physiological characteristics of Allium fistulosum

Full Text

Введение

Загрязнение биосферы антропогенными ксенобиотиками с каждым годом увеличивается, что приводит как к распространению толерантных к поллютантам видов растений, так и к исчезновению высокочувствительных видов. Возник закономерный интерес к раскрытию механизмов устойчивости видов к ингибирующему воздействию токсикантов. В этом плане, как правило, исследуются виды-индикаторы, но, очевидно, необходимо исследовать также виды, которые повсеместно распространены в самых различных экосистемах, в частности представители рода Allium.

Род Allium L. (сем. Amaryllidaceae) – один из крупнейших родов однодольных растений, включающий ряд овощных культур. По объему производства наиболее экономически значимыми представителями рода являются лук репчатый (A. cepa), чеснок (A. sativum) и лук-порей (A. porrum) [1, с. 4]. Представители этого рода рекомендованы ВОЗ для анализа генотоксичности антропогенных ксенобиотиков [2, с. 86–97].

Для видов рода Allium наиболее характерны патиентная и рудеральная составляющие стратегии жизни. Выживание видов (сохранение в составе фитоценоза) в неблагоприятных эколого-фитоценотических условиях чаще всего наиболее эффективно обеспечивают адаптивные механизмы патиентной (нишевой) составляющей стратегии жизни [3, с. 93–109; 4, с. 68–73]. Именно поэтому целесообразно в модельных экспериментах использовать представителей этого рода.

Когда в экотоксикологии ставятся модельные эксперименты по анализу биологических ответов изучаемых тест-объектов, необходимо использовать широко и давно применяемые ксенобиотики. Бензотриазол относится к таким ксенобиотикам. Он используется в фармакологической промышленности для синтеза новых лекарственных препаратов [5, с. 375–385], в металлургии в качестве ингибиторов коррозии [6], в химической промышленности в различных синтезах [7, с. 409–548] и как супрамолекулярные лиганды [8, с. 2515–2522]. Бензотриазол и его производные обнаруживаются в окружающей среде [9, p. 73–80; 10, p. 105–110]. Все вышесказанное делает его очень перспективным модельным поллютантом в экспериментах.

Целью исследования был анализ реакций Allium fistulosm L. на организменном уровне (всхожесть семян, рост корней) под действием спиртовых растворов бензотриазола в различных вариациях.

Материалы и методы

Объект исследования – A. fistulosm L. сорта Русский Зимний. Анализировали токсичность спиртовых растворов бензотриазола в концентрациях 0,0001; 0,001; 0,1 мг/мл. Растворителем служил 0,5% изопропиловый спирт.

Одновременно было поставлено 12 серий экспериментов. В каждой серии семена лука помещали на фильтровальную бумагу в чашки Петри, пропитанную исследуемыми растворами в избранной концентрации по 20 штук в каждую. Таким образом, для каждой серии исследовали 60 семян.

1 серия. Семена в течение 5 суток проращивали в 0,5% растворе изопропилового спирта.

2 серия. Семена в течение 5 суток проращивали в спиртовом растворе бензотриазола в концентрации 0,0001 мг/мл.

3 серия. Семена в течение 5 суток проращивали в бензотриазоле в концентрации 0,001 мг/мл.

4 серия. 60 семян в течение 5 суток проращивали в бензотриазоле в концентрации 0,1 мг/мл.

5 серия. Семена проращивали в течение 1 суток в растворе бензотриазола 0,0001 мг/мл, затем переносили в чашки Петри с бензотриазолом в концентрации 0,1 мг/мл, где проращивались еще 4 суток.

6 серия. Семена проращивали 2-е суток в растворе бензотриазола 0,0001 мг/мл, затем растения переносили в чашки Петри с бензотриазолом в концентрации 0,1 мг/мл, где растения росли еще 3-е суток.

7 серия. Семена проращивали 3-е суток в растворе бензотриазола 0,0001 мг/мл, затем переносили в чашки Петри с бензотриазолом в концентрации 0,1 мг/мл, где растения росли еще 2-е суток.

8 серия. Семена проращивали в течение 4 суток в растворе бензотриазола 0,0001 мг/мл, затем переносили в чашки Петри с бензотриазолом в концентрации 0,1 мг/мл, где растения росли еще 1 сутки.

9 серия. Семена проращивали в течение 1 суток в растворе бензотриазола 0,001 мг/мл, затем переносили в чашки Петри с бензотриазолом в концентрации 0,1 мг/мл, где растения росли еще 4 суток.

10 серия. Семена проращивали в течение 2-х суток в растворе бензотриазола 0,001 мг/мл, затем переносили в чашки Петри с бензотриазолом в концентрации 0,1 мг/мл, где растения росли еще 3-е суток.

11 серия. Семена проращивали в течение 3-х суток в растворе бензотриазола 0,001 мг/мл, затем переносили в чашки Петри с бензотриазолом в концентрации 0,1 мг/мл, где растения росли еще 2-е суток.

12 серия. Семена проращивали в течение 4 суток в растворе бензотриазола 0,001 мг/мл, затем переносили в чашки Петри с бензотриазолом в концентрации 0,1 мг/мл, где растения росли еще 1 сутки.

Подсчитывали всхожесть семян в процентах и среднюю длину корней на 5-й день роста. Достоверность различий между сериями экспериментов рассчитывали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа [11, с. 155–208].

Результаты и обсуждение

Растения, в отличие от животных, не способны активно избегать чужеродных соединений и поэтому вырабатывают стратегии выживания, позволяющие справиться с токсическим воздействием, развивая адаптивный ответ. Это один из широко известных эффектов малых доз, проявляющийся в том, что предварительное воздействие на клетки или организмы повреждающего агента в малых дозах увеличивает их устойчивость к повторному воздействию этого же, а иногда и другого агента в больших дозах [12, с. 59–67].

Мы поставили ряд серий экспериментов, где кратковременно воздействовали на лук низким дозами раствора бензотриазола, а потом переносили растения на высокую дозу 0,1 мг/мл этого же соединения. Исследовали две очень низкие дозы, а в качестве доказательств адаптивного ответа исследовали такие параметры, как всхожесть и длину корней. Чтобы оценить адаптивный ответ, результаты сравнивали с сериями экспериментов, в которых растения росли в течение пяти суток либо в трех исследованных концентрациях, либо в растворителе.

На рис. 1 представлены суммированные результаты экспериментов по выяснению возможности создания преадаптации растений к токсичной дозе бензотриазола в концентрации 0,1 мг/мл его же низкими дозами. Биологический ответ оценивали по такому физиологическому показателю, как всхожесть, подсчитывая изменение прорастания семян в различных сериях эксперимента.

Рисунок 1 – Влияние на всхожесть семян A. fistulosum бензотриазолом в разных концентрациях в различных сочетаниях (первая цифра в обозначениях на оси ординат говорит о длительности предварительного воздействия, «+» показывает длительность последующего воздействия высокой дозой)

Как видно из представленных результатов, преадаптация низкой дозой в течение суток оказывается недостаточной для развития адаптивного ответа, и процент проросших семян не отличается от такового при действии бензотразола в концентрации 0,1 мг/мл в течение 5 суток. Преадаптация в течение двух суток обеими низкими концентрациями вызвала адаптивный ответ, но эффективнее была преадаптация концентрацией 0,0001 мг/мл, так как процент проросших семян не отличался от такового в контроле, когда семена проращивали в 0,5% изопропиловом спирте. Проращивание растений в течение 5 суток на растворе бензотриазола в концентрации 0,0001 мг/мл показало стимулирующий эффект, так как число проросших семян было выше, чем в растворителе – изопропиловом спирте, то есть мы явно имеем дело с гормезисом.

Обычно при исследовании феномена гормезиса используют животных, и работ, проводимых на растениях, немного, но в последние годы возрос интерес к этому явлению. Были выявлены в реакциях древесных растений, используемых в качестве индикаторов, парадоксальные ответы на загрязнение окружающей среды автомобильными выхлопами, когда невысокие дозы стимулировали некоторые физиологические процессы [13, с. 432–437; 14, с. 396–398; 15, с. 76–78]. Было показано, что предпосевное γ-облучение семян ячменя влияет на развитие растений в течение всего вегетационного периода, стимулируя хозяйственно ценные признаки. Конкретная реализация эффекта гормезиса зависела от факторов среды, в которой происходило развитие растений [16, с. 823–826].

Наблюдаемые в области малых доз биологические эффекты обусловлены особенностями реализации ответной реакции клетки и организма, являющиеся результатом развертывания во времени генетической программы, выбор конкретного варианта которой определяется интенсивностью и характером внешнего воздействия. В нашем случае это длительность воздействия. Преадаптация в течение 3-х суток в обоих растворах низкой концентрации с последующим переносом растений в раствор бензотриазола с высокой концентрацией давало им возможность развить адаптивный ответ. Такой результат позволяет заключить, что именно при трехсуточной длительности создания преадаптации следует изучать механизмы этого процесса.

Проведенный двухфакторный дисперсионный анализ показал, что преадаптации разными дозами достоверно отличаются друг от друга (p< 0,050), а длительность преадаптации является важным фактором для развития адаптивного ответа (p< 0,02).

Всхожесть семян – это интегральный физиологический показатель состояния растения, зависящий от многих показателей: целостности семенной кожуры, веса семени, влажности и т.п. Поэтому необходимо исследование адаптивного ответа, являющегося частным случаем гормезиса, на более конкретные параметры состояния растения, например рост корней лука. Многие исследователи используют корни как тест-объекты анализа биологического действия токсикантов [17, с. 944–952], поэтому мы измеряли среднюю длину корней во всех сериях экспериментов и сравнивали полученные результаты между собой с целью выявления способности у низких доз бензотриазола создать преадаптации к токсическому действию его высокой дозы (0,1 мг/мл) для ростовых процессов. Результаты проведенных экспериментов показаны на рис. 2.

Рисунок 2 – Влияние на среднюю длину корней A. fistulosum бензотриазолом разных концентраций в различных сочетаниях (первая цифра в подписи на оси ординат говорит о времени предварительного воздействия, «+» показывает последующее воздействие и длительность высокой дозой)

Известно, что у растений переход в состояние стресса на организменном уровне заключается в интеграции сигналов на уровне апикальных меристем и усилении их формообразовательных и акцепторных свойств [18, с. 6]. Рост корней является суммарным итогом нескольких процессов: митотической активности в клетках корневой меристемы, процессов, идущих в зоне растяжения и т.д. Именно поэтому на этом уровне адаптивный ответ будет очень выраженным.

Преадаптация низкими дозами для роста корней, выявленная для всхожести семян, имеет те же закономерности.

Проведенный двухфакторный дисперсионный анализ показал, что на развитие адаптивного ответа, выражающегося в стимуляции ростовых процессов, достоверно влияет и концентрация нетоксических доз (p< 0,01), и продолжительность их воздействия (p< 0,02). Наиболее ярко адаптивный ответ наблюдается при воздействии низкими дозами в течение трех суток. Из представленных результатов видно, что при этой длительности воздействия обе концентрации дают сходный ответ.

По-видимому, высокая концентрация бензотриазола, выбранная нами, активирует защитные системы поддержания параметров гомеостаза, необходимые для выживания. При более низких концентрациях наблюдается «переключение» механизмов, обеспечивающих более тонкую регуляцию состояния организма, в результате чего наблюдается адаптивный ответ. Сходные процессы выявлены при радиационном гормезисе [19, с. 406–411; 20, с. 77–80].

Возможно, что за счет механизмов сверхкомпенсации явление гормезиса чаще будет наблюдаться у высокотолерантных к антропогенным ксенобиотикам растений.

Выводы

1. Выявлена способность низких концентраций бензотриазола вызывать адаптивный ответ у A. fistulosum проявляющийся как в показателях всхожести семян, так и ростовых процессах – средней длине корней тест-объекта.
2. Доказано, что оптимальное время для создания преадаптации к токсическому действию бензотриазола является воздействие низкими дозами в течение трех суток.
3. Обнаружено явление гормезиса при воздействии на A. fistulosum дозой бензотриазола в концентрации 0,0001 мг/мл.

About the authors

Ekaterina Sergeevna Selezneva

Author for correspondence.
Email: catana7@yandex.ru

candidate of biological sciences, associate professor of Zoology, Genetics and General Ecology Department

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Figure 1 - Effect of benzotriazole on seed germination of A. fistulosum in different concentrations in various combinations (the first number in the ordinate indicates the duration of the preliminary exposure, "+" indicates the duration of the subsequent exposure to a high dose)

Download (43KB)

Indexing metadata

3. Figure 2 - The effect of benzotriazole of different concentrations in various combinations on the average root length of A. fistulosum (the first digit in the caption on the ordinate indicates the time of preliminary exposure, "+" indicates the subsequent exposure and the duration of the high dose)

Download (36KB)

Indexing metadata