The effect of xylotrophic basidiomycetes on the photosynthetic pigments of small-leaved trees

Full Text

Введение

Ксилотрофные базидиомицеты являются важнейшим компонентом биоценозов. Особый комплекс ферментов позволяет этим микобионтам разрушать целлюлозу и делать доступным связанный углерод [1, с. 10–12; 2, p. 6070]. Эта группа преимущественно фитопатогенных организмов является типичным обитателем лесных биогеоценозов, а основным питательным субстратом для них является древесина лиственных и хвойных пород [3, p. 1714–1716; 4, p. 118]. При этом они осуществляют как деструкцию древесины погибших пород, так и ведут паразитический образ жизни на живых деревьях [5, с. 178; 6, p. 525]. И если для биоценоза это носит преимущественно положительный эффект за счет редукции целлюлозы, то для лесного хозяйства это является фактором, определяющим качество древесины [7, с. 75; 8, с. 13].

Данные фитопатогены приносят значительные убытки этой важнейшей в Костромской области отрасли [9, с. 4–6; 10, с. 54]. Одновременно не разработаны достаточно эффективные методы диагностики оценки поражения древесины ядровыми гнилями, которые вызываются ксилотрофными базидиомицетами [11, с. 61–65]. Также невозможно оценить степень фитопатогенного влияния на мелколиственные породы (только косвенно, используя общепринятый онтогенетический метод) [12, с. 15–30; 13, с. 5–10]. В связи с этим нами были разработаны методы изучения витальности мелколиственных пород по характеристикам хлорофилла, а также вспомогательных пигментов (каротиноидов и ксантофиллов) для выявления больных и ослабленных деревьев, пораженных ксилотрофными базидиомицетами.

Материалы и методы

Исследование витальности Betula pendula Roth и Populus tremula L. по характеристикам фотосинтетических пигментов проводилось в Красносельском, Макарьевском и Кологривском районах Костромской области. В основе применяемых методов лежит скорость деградации хлорофилла до феофитина, которая определяется с помощью спектроскопии с использованием спектроскопа однотрубного лабораторного и сравнительная электрофотоколориметрия для определения концентрации хлорофилла с применением электрофотоколориметра APEL AP-101 [14, с. 98; 15, p. 3–10]. Для проведения исследований в каждом районе подбиралось 3 дерева с соответствующим фитопатогеном, с каждого брали листовые пластинки в количестве достаточном для 3-х спиртовых извлечений, т.е. на контроль и каждый объект было исследовано по 27 образцов, что является репрезентативной выборкой [16, p. 641–650].

Для определения скорости деградации хлорофилла готовилась спиртовая вытяжка пигмента из листьев здоровых и больных деревьев, для этого 0,5 г измельченных листьев заливали 10 мл этилового спирта 70%. Затем каждые два дня проводилась спектроскопия в сравнении со спектральным составом чистого феофитина. Чем быстрей наблюдалась деградация хлорофилла до феофитина в сравнении с хлорофиллом, полученным от здоровых деревьев, тем более дерево оказывалось пораженным ксилотрофными базидиомицетами. По итогам наблюдения в среднем за 10 дней в зависимости от интенсивности поражения отмечалась полная деградация хлорофилла, полученного из листьев здоровых и больных деревьев до феофитина [17, с. 220].

Сравнительную электрофотоколориметрию проводили также с использованием спиртовой вытяжки хлорофилла, как и при спектроскопии. Исследование проводилось на приборе APEL AP-101, при этом определялась концентрация хлорофилла у здоровых и больных деревьев (мг/л) в сравнении со стандартным раствором Гётри. Раствор Гётри по окраске эквивалентен раствору хлорофилла концентрации 85 мг/л. Для исследования листья от здоровых и больных деревьев подбирались при одинаковых условиях освещенности, которая определялась с помощью люксметра Ю 116 с фотоэлементом Ф 55С. В электрофотоколориметре использовался светофильтр на 600 нм для определения концентрации хлорофилл a и 420 нм для определения концентрации хлорофилла b [14, с. 98; 18, с. 568–571].

Также исследовались и вспомогательные пигменты фотосинтеза, а именно каротиноиды и ксантофиллы, с использованием стандарта Русселя. Данный раствор по окраске эквивалентен раствору каротиноидов в концентрации 2,08 мг/л. Для определения концентрации каротина и ксантофилла в приборе APEL AP-101 использовали светофильтр 420 нм. В качестве исследуемого раствора, так же как и в предыдущих опытах, использовали спиртовую вытяжку из листьев мелколиственных пород. Феофитин определялся косвенным методом по деградации хлорофилла [14, с. 98]. Все полученные данные были статистически обработаны по общепринятым методикам.

Результаты и обсуждение

Проведенные спектроскопические исследования вытяжек хлорофилла из листовых пластин P. tremula и B. pendula, пораженных фитопатогенами, в сравнении с контролем показали схожие результаты. В качестве модельного объекта рассмотрим данные спектрограмм хлорофилла P. tremula в контроле и образцы, полученные от деревьев, пораженных P. igniarius. Первые спектрограммы были получены на второй день после выделения хлорофилла. В контроле отмечалось значительное поглощение спектра в синем (400–450 нм) и красном диапазонах (650–700 нм), это говорит о высоком содержании хлорофиллов a и b, поскольку именно в этих участках наиболее высокая поглотительная способность этих пигментов. Кроме этого, в диапазоне 550 нм наблюдалось практически полное поглощение монохроматического света видимой зеленой области спектра, что соотносится с законами Бугера–Ламберта и Бера, это также говорит о высоком содержании основных пигментов фотосинтеза – хлорофиллов (рис. 1). На 10-й день наблюдений внешне вытяжка пигментов приобрела болотную окраску, поскольку часть хлорофилла деградировала до феофитина, изменилась также и спектрограмма, в целом уменьшилась интенсивность поглощения спектра в синем и красном диапазонах, за счет чего эти участки лучше стали проявляться на спектрограмме. Кроме того, появилась видимая зеленая область спектра, поскольку хлорофилла стало меньше и полного поглощения монохроматического света уже не наблюдалось (рис. 1).

 

Рисунок 1 – Спектрограмма вытяжки хлорофилла из контрольных образцов P. tremula на 2-й день (А) и на 10-й день (Б)

 

На спектрограмме вытяжки хлорофилла из листовых пластинок от деревьев, пораженных P. igniarius, на второй день отмечалось поглощение спектров, которое соответствовало примерно спектрограмме 8–10-го дня в контроле. Это значит, что разрушение и деградация основных пигментов фотосинтеза до феофитина шло более быстрыми темпами, что в дальнейшем подтвердилось при проведении электрофотоколориметрии. К тому же в диапазоне 550 нм не наблюдалось поглощения монохроматического света видимой зеленой области спектра, что также говорит о низком уровне хлорофиллов. На 10-й день на спектрограмме синий и красный спектры стали практически соответствовать показаниям прохождения света через простую воду, хлорофилл a и b практически полностью деградировали до феофитина (рис. 2).

 

Рисунок 2 – Спектрограмма вытяжки хлорофилла из образцов P. tremula, пораженных P. igniarius на 2-й день (А) и на 10-й день (Б)

 

Электрофотоколориметрический анализ вытяжки пигментов фотосинтеза из листовых пластинок P. tremula показал значительно меньшую концентрацию хлорофилла a (32,1 мг/л) в образцах, полученных от деревьев, пораженных P. igniarius, в сравнении с контрольным образцом (56,6 мг/л), кроме того, и хлорофилл a, и хлорофилл b значительно быстрее разрушались в вытяжке из листьев пораженных деревьев (табл. 1).

 

Таблица 1 – Электрофотоколориметрический анализ вытяжки пигментов фотосинтеза из листовых пластинок P. tremula здоровых и пораженных P. igniarius деревьев, мг/л

Сутки	Пигменты фотосинтеза	Контроль (n = 18), $\overline{X}$ ± Sₓ	P. igniarius (n = 18), $\overline{X}$ ± Sₓ
1	Хлорофилл a	56,6 ± 1,3	32,1 ± 1,71
	Хлорофилл b	8,5 ± 0,02	7,3 ± 0,12
	Каротиноиды	4,2 ± 0,04	3,6 ± 0,06
	Феофитин	0	0
3	Хлорофилл a	35,4 ± 0,43	11,2 ± 1,76
	Хлорофилл b	8,0 ± 0,44	3,7 ± 0,24
	Каротиноиды	4,0 ± 0,23	1,8 ± 0,13
	Феофитин	21,5 ± 1,23	24,5 ± 3,16
5	Хлорофилл a	32,6 ± 1,35	9,7 ± 1,88
	Хлорофилл b	7,6 ± 0,28	2,8 ± 0,29
	Каротиноиды	3,8 ± 0,12	1,4 ± 0,16
	Феофитин	25,0 ± 1,14	26,8 ± 3,57
7	Хлорофилл a	32,3 ± 1,82	9,5 ± 1,63
	Хлорофилл b	7,4 ± 0,27	2,8 ± 0,26
	Каротиноиды	3,7 ± 0,16	1,4 ± 0,12
	Феофитин	25,4 ± 1,28	27,2 ± 3,44
9	Хлорофилл a	28,7 ± 1,28	9,6 ± 1,30
	Хлорофилл b	6,7 ± 1,07	2,7 ± 0,28
	Каротиноиды	3,4 ± 0,53	1,3 ± 0,14
	Феофитин	29,7 ± 1,32	27,1 ± 2,98

 

Уже на второй день концентрация феофитина (20,5 мг/л) стала превышать концентрацию хлорофилла a (14,3 мг/л), и эта тенденция сохранялась на протяжении всего периода проведения замеров. В контроле лишь на 9-й день концентрация феофитина (29,7 мг/л) стала больше по сравнению с концентрацией хлорофилла a (28,7 мг/л). Медленнее шла также деградация и окисление хлорофилла b и других вспомогательных пигментов фотосинтеза именно в контрольном образце (рис. 3).

 

Рисунок 3 – Сравнительная характеристика основных и вспомогательных пигментов фотосинтеза у P. tremula в контроле (А) и при поражении P. igniarius (Б)

 

По промежуточным результатам исследований можно отметить значительное влияние P. igniarius на жизненность P. tremula, что, безусловно, сказывается как на биологических и физиологических процессах самих деревьев, так и на возможности хозяйственного использования древесины этой породы. Фитопатоген не только замедляет рост дерева, но и значительно ухудшает качество получаемой древесины.

Исследования вытяжек из листовых пластинок B. pendula также позволили выявить определенные закономерности деградации и разрушения основных и вспомогательных пигментов фотосинтеза (табл. 2).

 

Таблица 2 – Электрофотоколориметрический анализ вытяжки пигментов фотосинтеза из листовых пластинок B. pendula здоровых и пораженных фитопатогенами деревьев, мг/л

Сутки	Пигменты фотосинтеза	Контроль (n = 18), $\overline{X}$ ± Sₓ	I. obliquus (n = 18), $\overline{X}$ ± Sₓ	F. fomentarius (n = 18), $\overline{X}$ ± Sₓ	P. betulinus (n = 18), $\overline{X}$ ± Sₓ
1	Хлорофилл a	17,7 ± 0,78	22,9 ± 2,08	17,4 ± 1,51	16,8 ± 1,31
	Хлорофилл b	4,5 ± 0,08	5,3 ± 0,27	5,4 ± 0,08	5,5 ± 0,14
	Каротиноиды	2,2 ± 0,06	2,7 ± 0,13	2,7 ± 0,05	2,8 ± 0,08
	Феофитин	0	0	0	0
3	Хлорофилл a	10,1 ± 0,57	9,9 ± 1,12	11,5 ± 1,08	10,4 ± 0,38
	Хлорофилл b	2,8 ± 0,11	3,0 ± 0,24	3,5 ± 0,60	3,8 ± 0,03
	Каротиноиды	1,4 ± 0,05	1,5 ± 0,11	2,0 ± 0,14	1,9 ± 0,03
	Феофитин	9,3 ± 0,50	15,4 ± 1,25	7,8 ± 1,21	8,1 ± 1,76
5	Хлорофилл a	5,7 ± 0,61	7,8 ± 1,04	9,6 ± 0,93	9,2 ± 0,23
	Хлорофилл b	2,0 ± 0,11	2,1 ± 0,14	2,8 ± 0,27	2,8 ± 0,08
	Каротиноиды	1,0 ± 0,05	1,1 ± 0,07	1,4 ± 0,14	1,4 ± 0,05
	Феофитин	14,4 ± 0,18	18,3 ± 1,23	10,4 ± 0,63	10,2 ± 1,61
7	Хлорофилл a	5,6 ± 0,64	7,2 ± 1,08	9,5 ± 0,90	9,8 ± 0,25
	Хлорофилл b	1,6 ± 0,09	1,7 ± 0,20	2,7 ± 0,28	2,9 ± 0,12
	Каротиноиды	0,8 ± 0,05	0,9 ± 0,09	1,3 ± 0,15	1,4 ± 0,07
	Феофитин	14,9 ± 0,22	19,3 ± 1,06	10,5 ± 0,67	9,6 ± 1,57
9	Хлорофилл a	6,0 ± 0,70	7,1 ± 1,00	10,1 ± 0,91	10,3 ± 0,32
	Хлорофилл b	1,6 ± 0,13	1,7 ± 0,16	2,7 ± 0,32	2,9 ± 0,15
	Каротиноиды	0,8 ± 0,07	0,9 ± 0,08	1,3 ± 0,16	1,5 ± 0,08
	Феофитин	14,7 ± 0,28	19,4 ± 1,22	10,0 ± 0,55	9,1 ± 1,47

 

В целом контрольный образец B. pendula имел значительные отличия от контрольного образца P. tremula. Хлорофилл a уже к 4-му дню деградировал так, что его стало меньше по сравнению с концентрацией феофитина (9,7 мг/л против 10,0 мг/л). В целом такая тенденция обнаруживается для всех образцов, полученных из листовых пластинок B. pendula, в том числе и для растений, пораженных ксилотрофными базидиомицетами, в связи с этим по данному показателю нельзя оценить влияние фитопатогенов на пигментный аппарат растения. По начальной концентрации хлорофилла a (17,7 мг/л) контроль уступал только вытяжке, полученной из листовых пластинок B. pendula, пораженных I. obliquus (22,9 мг/л), хотя это объясняется тем, что данный фитопатоген может жить только на живых деревьях, в связи с этим, это может быть проявлением компенсаторной реакции дерева в ответ на жизнедеятельность фитопатогена [19, с. 20; 20, с. 402]. Кроме этого, об умеренном фитопатогенном действии I. obliquus говорит и тот факт, что характер и скорость деградации хлорофилла a схож с контрольным образцом, что видно на графиках (рис. 4). Если же рассматривать начальную концентрацию в контроле хлорофилла b (4,5 мг/л), можно заметить, что в извлечениях, полученных от пораженных деревьев, его почти на 1 мг больше, это также реакция компенсации в ответ на ксилотрофное действие фитопатогенов.

 

Рисунок 4 – Сравнительная характеристика основных и вспомогательных пигментов фотосинтеза у B. pendula в контроле (А) и при поражении фитопатогенами: I. obliquus (Б), F. fomentarius (В), P. betulinus (Г)

 

При выполнении замеров был обнаружен также вираж концентрации хлорофилла a во всех образцах. Вираж характеризуется тем, что после ряда дней стабильной деградации хлорофилла до феофитина со снижением концентрации первого и повышением концентрации второго вдруг возникает повышение концентрации хлорофилла и в дальнейшем отмечается непрогнозируемое колебание этих показателей. Это связано с тем, что не весь хлорофилл деградирует до феофитина, часть его окисляется до других продуктов метаболизма, что не может отразить электрофотоколориметр с заданными параметрами длины волны. Чем быстрей наступает вираж, тем сильней влияние фитопатогена на жизненность растения. В норме вираж обычно отмечается к 9–10-му дню замеров, что можно видеть в контрольном образце (9-й день), для деревьев, пораженных I. obliquus, вираж также отмечен на 9-й день. А у образцов, полученных из листовых пластинок B. pendula, пораженных F. fomentarius и P. betulinus, вираж отмечен уже на 6-й день. В целом это соотносится с тем, что отбор листовых пластинок, как правило, производился с деревьев, которые относились к сенильным растениям с низкой жизненностью, поскольку на молодых и здоровых растениях этих фитопатогенов обнаружить не удавалось.

Анализ вытяжки из листовых пластинок B. pendula с использованием электрофотоколориметрического метода показал более разнородный результат, что, по-видимому, связано с особенностями влияния того или иного фитопатогена на основные и вспомогательные пигменты фотосинтеза. Однако метод электрофотоколориметрии можно применять для исследования как явного, так и скрытого влияния ксилотрофных базидиомицетов на рост и жизнедеятельность B. pendula и в дальнейшем проводить оценку возможностей хозяйственного использования древесины этой мелколиственной породы.

Заключение

Использование методов спектроскопии и электрофотоколориметрии для исследования и определения концентрации основных и вспомогательных пигментов фотосинтеза и последующей оценки влияния фитопатогенов на фотосинтетический аппарат деревьев мелколиственных пород показали свою эффективность. С помощью этих методов было установлено значительное влияние ксилотрофных базидиомицетов на жизненность P. tremula и B. pendula, что отражается не только на биологических и физиологических процессах самих деревьев, но и на возможности хозяйственного использования древесины этих пород. С помощью электрофотоколориметрии удалось установить целую серию воздействий на пигментный аппарат фитопатогенов, таких как скорость деградации и вираж хлорофилла a, более высокая концентрация хлорофилла b у пораженных деревьев в сравнении с контролем. Данные методы и полученные результаты можно активно применять как в лесном хозяйстве для оценки фитосанитарного состояния деревьев мелколиственных пород, так и для дальнейшего изучения особенностей взаимодействия ксилотрофных базидиомицетов с древесными растениями.

About the authors

Eduard Vladimirovich Maramokhin

Kostroma State University

Author for correspondence.
Email: maramokhin91@mail.ru

senior lecturer of Biology and Ecology Department

Russian Federation, Kostroma

Marina Valerievna Sirotina

Kostroma State University; State Natural Reserve «Kologrivsky Forest» named after M.G. Sinitsyn

Email: mvsirotina@gmail.com

doctor of biological sciences, associate professor, head of Biology and Ecology Department, researcher

Russian Federation, Kostroma; Kologriv, Kostroma Region

Dmitry Nikolaevich Zontikov

Kostroma State University

Email: zontikovd@mail.ru

candidate of agricultural sciences, senior researcher, head of Plant Biotechnology Laboratory

Russian Federation, Kostroma

Vladislav Sergeevich Golubev

Kostroma State University

Email: vladislav.golubew2016@yandex.ru

postgraduate student of Economics and Management Department

Russian Federation, Kostroma

References

Supplementary files