Перспективность использования регуляторов роста растений на индукцию каллусогенеза различных типов эксплантов Hyoscyamus muticus L. in vitro
- Авторы: Абделазиз В.А.1, Хуснетдинова Л.З.1, Тимофеева О.А.1
-
Учреждения:
- Казанский (Приволжский) федеральный университет
- Выпуск: Том 7, № 3 (2018)
- Страницы: 10-13
- Раздел: 03.02.00 – общая биология
- URL: https://snv63.ru/2309-4370/article/view/21678
- DOI: https://doi.org/10.17816/snv201873101
- ID: 21678
Цитировать
Полный текст
Аннотация
В работе представлены результаты по изучению влияния гормонального состава среды на индукцию каллусогенеза в культуре изолированных органов белены египетской (Hyoscyamus muticus L.). Было испытано 11 вариантов сред Мурасиге и Скуга, дополненных ауксинами и цитокининами. Подобранны модификации питательных сред Мурасиге и Скуга для каллусогенеза. Установлено, что на среде Мурасиге и Скуга содержащей бензиламинопурин в сочетании с нафтилуксусной кислотой наблюдалось каллусообразование из разных типов эксплатов Hyoscyamus muticus L. in vitro. Показано, что максимальная индукция каллусогенеза из корневых эксплантов, наблюдалась при использовании среды Мурасиге и Скуга, дополненной 0,5 мг/л бензиламинопурином и 1,0 мг/л нафтилуксусной кислотой, тогда как минимальное каллусообразование наблюдалось на среде, содержащей только бензиламинопурин. Установлено, что индукция каллусогенеза из листовых и стеблевых эксплантов на питательной среде, не содержащей гормонов, а также при введении в состав среды только бензиламинопурина не отмечалась. Таким образом, на большинстве испытанных питательных сред индукция каллусогенеза выше при культивировании фрагментов корня по сравнению с листовыми и стеблевыми эксплантами белены египетской в культуре in vitro. Данная работа направлена на то, чтобы индуцировать образование каллуса из различных эксплантов белены египетской, которые могут быть использованы для регенерации растений и в качестве источника для получения вторичных метаболитов.
Полный текст
Введение
Hyoscyamus muticus L. – многолетнее травянистое растение семейства пасленовые (Solanaceae). Семейство Solanaceae включает в себя около 102 родов и 2460 видов, обитающих в тропических и субтропических районах. Они являются продуцентами сходных по химическому строению тропановых алкалоидов. Показано, что биологическая активность белены связана с присутствием в нем скополамина, гиосциамина и атропина [1, p. 113–119; 2, p. 39–42]. В лекарственных целях белену египетскую применяют как противоастматическое, спазмолитическое, антихолинергическое, анестезирующее и наркотическое средство.
H. muticus на территории Российской Федерации не произрастает, и постепенно вырождается в Египте из-за быстрого развития индустриализации. Этот факт определяет наши попытки разработать биотехнологические методы размножения ценного растения в целях его сохранения и получения вторичных метаболитов. Разработка таких подходов основана прежде всего на оптимизации режимов асептического культивирования тканей и органов и подборе условий индукции каллуса различных типов эксплантов [3, p. 1273–1276; 4, p. 620–626; 5, p. 423–428; 6, p. 751–756]. Целью исследований является изучение влияния культуральных сред различного гормонального состава на каллусогенную активность различных типов эксплантатов H. muticus in vitro.
Материалы и методика исследований
Материалом для исследования служили семена H. muticus, полученные с сельскохозяйственного факультета университета Аль-Азхар (Египет). В качестве первичных эксплантов для введения в культуру in vitro были использованы сегменты листьев, стеблей, корней из проростков семян белены. Для стерилизации семян использовали 1,5% раствор NaOCl в течение 10 минут, с последующим промыванием стерилизованной дистиллированной водой (4–5 раз) [7, с. 25–34] и культивировали на твердой безгормональной питательной среде Мурасиге и Скуга (МС) [8, p. 473–497] с добавлением 100 мг/л миоинозитола и 30 г/л сахарозы с 2,5 г/л фитагеля.
Культивирование эксплантов проводили на среде MC, дополненной различными комбинациями бензиламинопурина (БАП) и нафтилуксусной кислоты (НУК) традиционными методами [9, с. 488]. В качестве контроля во всех экспериментах служила безгормональная питательная среда. Экспланты выращивали в культуральных помещениях при освещенности 3000 Люкс и 16-часовом фотопериоде, температуре воздуха 26 ± 2°C, относительной влажности воздуха 70%.
Статистический анализ полученных результатов проводили с использованием программы OriqinPro 9.0. Для представления результатов использовали среднее значение и стандартное отклонение. Достоверность различий оценивали по U тесту Mann Whitney при p < 0,05.
Результаты исследований и их обсуждение
При введении эксплантов в культуру in vitro, образование каллусной ткани происходит в результате дедифференцировки клеток исходного эксплантов и их дальнейшего деления. Экспериментальные данные, имеющиеся в литературе, свидетельствуют о том, что способность к каллусообразованию в значительной степени определяется типом и концентрацией ауксинов и цитокининов. При этом для каждого вида или даже сорта необходим различный гормональный состав питательных сред. Наши исследования также показали, что индукция образования первичного каллуса у H. muticus зависела от гормонального состава питательной среды и типа экспланта.
При культивировании сегментов листа, стебля и корня на среде МС использовали отдельно БАП в концентрациях 1,0, 2,0 и 3,0 мг/л и БАП в сочетании с НУК: 0,5 мг/л БАП с 0,5, 1,0, 2,0 и 3,0 мг/л НУК, и 1,0, 2,0 и 3,0 мг/л БАП с 1,0 мг/л НУК.
В ходе исследования влияния гормонального состава питательной среды на процесс индукции каллусогенеза было испытано 11 модификаций стандартной среды МС, характеризующихся содержанием различных концентраций ауксина и цитокинина. Установлено, что на безгормональной питательной среде, а также при введении в состав среды только БАП не наблюдали индукции каллусогенеза из листовых и стеблевых эксплантов. На остальных исследуемых питательных средах на 35–40 дни наблюдали появление каллусной ткани.
В результате проведенных исследований было показано, что у эксплантов, полученных из сегментов листа, низкое образование каллуса наблюдали на среде МС, содержащей 0,5 мг/л БАП и 2,0 мг/л НУК (в среднем 13,64 мг/эксплант сырого каллуса и 0,48 мг/эксплант сухого каллуса) (табл. 1). Максимальное каллусообразование наблюдали при использовании 1,0 мг/л БАП в сочетании с 1,0 мг/л НУК. В среднем сырой и сухой вес каллуса составил 20,11 и 0,67 мг/эксплант соответственно.
Среда, содержащая 2,0 мг/л БАП в сочетании с 1,0 мг/л НУК, оказалась самой эффективной для индукции каллуса из стеблей H. muticus. Масса сырого и сухого каллуса составила 21,81 мг/эксплант и 0,90 мг/эксплант соответственно (табл. 2). Экспланты, культивировавшиеся на среде МС, дополненной 0,5 мг/л БАП в сочетании с 2,0 мг/л НУК, показали самое минимальное каллусообразование (в среднем 7,40 и 0,31 мг/эксплант сырого и сухого каллуса).
Таблица 1 – Влияние БАП и НУК на индукцию каллуса из листовых эксплантов H. muticus
Концентрация регуляторов роста, мг/л | Каллусообразование, % | Сырая биомасса каллуса, мг/эксплант | Сухая биомасса каллуса, мг/эксплант | |
БАП | НУК | |||
0,0 | 0,0 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
1,0 | 0,0 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
2,0 | 0,0 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
3,0 | 0,0 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
0,5 | 0,5 | 100 | 15,28 ± 0,10 | 0,61 ± 0,05 |
0,5 | 1,0 | 100 | 14,08 ± 0,09 | 0,62 ± 0,03 |
0,5 | 2,0 | 100 | 13,64 ± 0,43 | 0,48 ± 0,05 |
0,5 | 3,0 | 100 | 15,19 ± 0,55 | 0,50 ± 0,09 |
1,0 | 1,0 | 100 | 20,11 ± 0,60 | 0,67 ± 0,07 |
2,0 | 1,0 | 100 | 14,58 ± 0,33 | 0,56 ± 0,05 |
3,0 | 1,0 | 100 | 17,07 ± 0,17 | 0,58 ± 0,03 |
Таблица 2 – Влияние БАП и НУК на индукцию каллуса из стеблевых эксплантов H. muticus
Концентрация регуляторов роста, мг/л | Каллусообразование, % | Сырая биомасса каллуса, мг/эксплант | Сухая биомасса каллуса, мг/эксплант | |
БАП | НУК | |||
0,0 | 0,0 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
1,0 | 0,0 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
2,0 | 0,0 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
3,0 | 0,0 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
0,5 | 0,5 | 100 | 16,27 ± 0,43 | 0,64 ± 0,04 |
0,5 | 1,0 | 100 | 12,30 ± 1,54 | 0,40 ± 0,09 |
0,5 | 2,0 | 100 | 7,40 ± 0,48 | 0,31 ± 0,06 |
0,5 | 3,0 | 100 | 13,84 ± 1,24 | 0,49 ± 0,09 |
1,0 | 1,0 | 100 | 12,54 ± 0,63 | 0,40 ± 0,09 |
2,0 | 1,0 | 100 | 21,81 ± 0,94 | 0,90 ± 0,07 |
3,0 | 1,0 | 100 | 8,10 ± 0,28 | 0,25 ± 0,05 |
Индукция каллусогенеза из корневых эксплантов H. muticus, как видно из полученных данных (табл. 3), наблюдалась на среде, содержащей отдельно БАП и БАП в сочетании с НУК, тогда как на безгормональной среде каллус не образовывался.
При этом минимальное каллусообразование из корневых эксплантов наблюдали на среде МС, содержащей только БАП. У эксплантов, культивировавшихся на среде МС, дополненной 0,5 мг/л БАП в сочетании с 1,0 мг/л НУК, отмечали максимальное образование сырой (31,56 мг/эксплант) и сухой (1,04 мг/эксплант) биомассы.
Во многих научных исследованиях показано, что ауксины и цитокинины оказывают значительное влияние на индукцию каллуса, тогда как безгормональная среда МС, не оказывает положительного влияния на каллусообразование у большинства растений семейства Solanaceae [10, p. 874–882; 11, p. 382–392; 12, p. 1236–1242; 13, p. 1858–1866; 14, p. 40–46; 15, p. 47–50]. В работах [16, p. 38–44], показано, что самый высокий процент индукции каллуса из листовых эксплантов Physalis minima Linn. наблюдали на среде МС, содержащая 2,4-Д (90%), НУК (70%) и ИУК (50%). Отмечено, что питательная среда МС, содержащая БАП в сочетании с НУК, наиболее эффективна для индукции каллуса из листовых эксплантов H. niger L. и Datura metal [13, p. 1858–1866]. Самый высокий процент индукции каллуса наблюдали на среде МС, содержащая БАП в сочетании с НУК из листовых эксплантов Solanum nigrum L. [17, p. 99–103], Withania somnifera L. [18, p. 58–61], Stevia rebaudiana [19, p. 56–60], Biophytum sensitivum [20, p. 127–131].
Таблица 3 – Влияние БАП и НУК на индукцию каллуса из корневых эксплантов H. muticus
Концентрация регуляторов роста, мг/л | Каллусообразование, % | Сырая биомасса каллуса, мг/эксплант | Сухая биомасса каллуса, мг/эксплант | |
БАП | НУК | |||
0,0 | 0,0 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
1,0 | 0,0 | 80 | 2,13 ± 0,75 | 0,12 ± 0,03 |
2,0 | 0,0 | 100 | 6,88 ± 0,74 | 0,24 ± 0,03 |
3,0 | 0,0 | 73,34 | 1,47 ± 0,35 | 0,08 ± 0,03 |
0,5 | 0,5 | 100 | 28,48 ± 1,12 | 0,79 ± 0,08 |
0,5 | 1,0 | 100 | 31,56 ± 1,07 | 1,04 ± 0,04 |
0,5 | 2,0 | 100 | 13,52 ± 0,49 | 0,34 ± 0,04 |
0,5 | 3,0 | 100 | 18,04 ± 0,67 | 0,55 ± 0,04 |
1,0 | 1,0 | 100 | 24,50 ± 0,64 | 0,73 ± 0,06 |
2,0 | 1,0 | 100 | 19,04 ± 0,86 | 0,52 ± 0,06 |
3,0 | 1,0 | 100 | 14,79 ± 0,50 | 0,50 ± 0,02 |
Тем не менее, каллусная ткань в наших исследованиях лучше всего формировалась на сегментах корней, тогда как на листовых и стеблевых эксплантах наблюдали лишь единичное образование длительно культивируемого каллуса, способного к дальнейшей пролиферации (рис. 1). Через 5 недель вследствие интенсивной пролиферации, каллусные культуры, полученные из корневых эксплантов, характеризовались следующими морфологическими особенностями: однородные, рыхлые, оводненные каллусы от светло-бежевого до светло-зеленого цвета, иногда с бурыми участками.
Рисунок 1 – Каллусообразование из корневых эксплантов на среде МС, дополненной 0,5 мг/л БАП в сочетании с 1,0 мг/л НУК
Таким образом, проведенные экспериментальные исследования показали, что индукция образования и интенсивность роста каллусной ткани H. muticus in vitro зависела от регуляторов роста и типа экспланта. Максимальное каллусообразование получено из корневых эксплантов в отличие от листовых и стеблевых сегментов. При этом следует отметить, что в питательной среде необходимо наличие регуляторов роста как цитокининовой, так и ауксиновой природы.
Об авторах
Валла Абделмаксуд Абделазиз
Казанский (Приволжский) федеральный университет
Email: wallamohamed68@gmail.com
аспирант кафедры ботаники и физиологии растений
Россия, КазаньЛандыш Завдетовна Хуснетдинова
Казанский (Приволжский) федеральный университет
Email: husnetdinova.l@mail.ru
кандидат биологических наук, доцент кафедры ботаники и физиологии растений
Россия, КазаньОльга Арнольдовна Тимофеева
Казанский (Приволжский) федеральный университет
Автор, ответственный за переписку.
Email: olga.timofeeva@kpfu.ru
доктор биологических наук, профессор кафедры ботаники и физиологии растений
Россия, КазаньСписок литературы
- Khater M.A., Elashtokhy M.M.A. Effect of growth regulators on in vitro production of Hyoscyamus aureus L. and tropane alkaloids // International journal of ChemTech Research. 2015. Vol. 8 (11). P. 113-119.
- Basu P. Tropane alkaloids from callus cultures, differentiated roots and shoots of Hyoscyamus muticus L. // Plant Biochem Biotechnol. 1998. P. 39-42.
- Bahorun T., Trotin F., Vasseux J. Comparative polyphenolic productions in Crataegus monogyna callus cultures // Phytochemistry. 1994. Vol. 37 P. 1273-1276.
- Balz J.P., Courtois D., Drieu J., Drieu K. Production of ginkgolides and bilobalide by Ginkgo biloba plants and tissue culture // Planta Medica. 1999. Vol. 65 (7). P. 620-626.
- El-Bahr M.K., Ghanem S.A., El-Missiry M.M., El-Nasr M.M. Production of tropane alkaloids in tissue cultures of Hyoscyamus muticus // Fitoterapia. 1997. Vol. 68 (5). P. 423-428.
- Zhentian L., Jervis J., Helm R.F. C-glycosidic ellagitannins from white oak heartwood and callus tissues // Phytochemistry. 1999. Vol. 51 (6). P. 751-756.
- Elmaksood W.A.M., Fawzia A., Hussein A. Bosila. In vitro Propagation of the Endangered Medicinal Plant Hyoscyamus muticus L. (Egyptian henbane) // Journal of Applied Environmental and Biological Sciences. 2016. Vol. 6 (4)1-1. P. 25-34.
- Murashige T., Skoog F.A. Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol Plant. 1962. Vol. 15. P. 473-497.
- Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. К.: Наук. Думка, 1980. 488 с.
- Aljibouri A.M.J., Al-samarraei K.W., Abd A.S., Mageed D.M. Alkaloids Production from Callus of Hyoscyamus niger L. in vitro // Journal of Life Sciences. 2012. Vol. 6. P. 874-882.
- Ibrahim A.I., Abd El Kawi M., Nower A., Abdel Motaal A. Alkaloids production and organogenesis from callus of Hyoscyamus muticus L. in vitro // J. of Applied Sciences Research. 2009. Vol. 5. P. 382-392.
- Iranbakhsh A.R., Oshagi M.A., Ebadi M. Growth and production optimization of tropane alkaloids in Datura stramonium cell suspension culture // Pakistan Journal of Biological Sciences. 2007. Vol. 10. P. 1236-1242.
- Abd-Rahman R., El-Din E.H., El-Said A., Khlifa H.D. Production of scopolamine and hyoscyamine in callus and regenerate cultures of Datura metel (L.) // J. of Applied Science Research. 2008. Vol. 4. P. 1858-1866.
- Mutasim M.K., Khadiga G.A.E., Rasheid S.M. Callus formation and organogenesis of potato (Solanum tuberosum L.) cultivar Almera // Journal of Phytology. 2010. Vol. 2 (5). P. 40-46.
- Nistor A., Campeanu G.H., Nicoleta C., Diana K.C. Effect of auxin and cytokinin on callus induction in potato (Solanum tuberosum L.) explants // Agricultura Stiinta si practica. 2009. Vol. 12. P. 47-50.
- Sandhya H., Srinath R. Role of growth regulators on in vitro callus induction and direct regeneration in Physalis minima Linn // International Letters of Natural Sciences. 2015. Vol. 44. P. 38-44.
- Yogananth N., Bhakyaraj R., Chanthuru A., Parvathi S. Comparative analysis of solasodine from in vitro and in vivo cultures of Solanum nigrum Linn // Kathmandu university journal of science, engineering and technology. 2009. Vol. 5 (1). P. 99-103.
- Adhikari S.R., Pant B. Induction and Proliferation of in vitro Mass of Callus of Withania somnifera (L.) Dunal // Research in Plant Sciences. 2013. Vol. 1 (3). P. 58-61.
- Preethi M., Sridhar T.M., Naidu C.V. Efficient protocol for indirect shoot regeneration from leaf explants of Stevia rebaudiana (Bert.) - An important calorie free bio sweetener // Journal of Phytology. 2011. Vol. 3 (5). P. 56-60.
- Shivanna M.B., Vasanthakumara M.M., Mangala C. Regeneration of Biophytum sensitivum (Linn.) DC. Through organogenesis and somatic embryogenesis // Indian Journal of Biotechnology. 2009. Vol. 8. P. 127-131.
Дополнительные файлы
![](/img/style/loading.gif)