Future outlook of plant growth regulators application influencing callus induction from different type explant Hyoscyamus muticus L. in vitro

Full Text

Введение

Hyoscyamus muticus L. – многолетнее травянистое растение семейства пасленовые (Solanaceae). Семейство Solanaceae включает в себя около 102 родов и 2460 видов, обитающих в тропических и субтропических районах. Они являются продуцентами сходных по химическому строению тропановых алкалоидов. Показано, что биологическая активность белены связана с присутствием в нем скополамина, гиосциамина и атропина [1, p. 113–119; 2, p. 39–42]. В лекарственных целях белену египетскую применяют как противоастматическое, спазмолитическое, антихолинергическое, анестезирующее и наркотическое средство.

H. muticus на территории Российской Федерации не произрастает, и постепенно вырождается в Египте из-за быстрого развития индустриализации. Этот факт определяет наши попытки разработать биотехнологические методы размножения ценного растения в целях его сохранения и получения вторичных метаболитов. Разработка таких подходов основана прежде всего на оптимизации режимов асептического культивирования тканей и органов и подборе условий индукции каллуса различных типов эксплантов [3, p. 1273–1276; 4, p. 620–626; 5, p. 423–428; 6, p. 751–756]. Целью исследований является изучение влияния культуральных сред различного гормонального состава на каллусогенную активность различных типов эксплантатов H. muticus in vitro.

Материалы и методика исследований

Материалом для исследования служили семена H. muticus, полученные с сельскохозяйственного факультета университета Аль-Азхар (Египет). В качестве первичных эксплантов для введения в культуру in vitro были использованы сегменты листьев, стеблей, корней из проростков семян белены. Для стерилизации семян использовали 1,5% раствор NaOCl в течение 10 минут, с последующим промыванием стерилизованной дистиллированной водой (4–5 раз) [7, с. 25–34] и культивировали на твердой безгормональной питательной среде Мурасиге и Скуга (МС) [8, p. 473–497] с добавлением 100 мг/л миоинозитола и 30 г/л сахарозы с 2,5 г/л фитагеля.

Культивирование эксплантов проводили на среде MC, дополненной различными комбинациями бензиламинопурина (БАП) и нафтилуксусной кислоты (НУК) традиционными методами [9, с. 488]. В качестве контроля во всех экспериментах служила безгормональная питательная среда. Экспланты выращивали в культуральных помещениях при освещенности 3000 Люкс и 16-часовом фотопериоде, температуре воздуха 26 ± 2°C, относительной влажности воздуха 70%.

Статистический анализ полученных результатов проводили с использованием программы OriqinPro 9.0. Для представления результатов использовали среднее значение и стандартное отклонение. Достоверность различий оценивали по U тесту Mann Whitney при p < 0,05.

Результаты исследований и их обсуждение

При введении эксплантов в культуру in vitro, образование каллусной ткани происходит в результате дедифференцировки клеток исходного эксплантов и их дальнейшего деления. Экспериментальные данные, имеющиеся в литературе, свидетельствуют о том, что способность к каллусообразованию в значительной степени определяется типом и концентрацией ауксинов и цитокининов. При этом для каждого вида или даже сорта необходим различный гормональный состав питательных сред. Наши исследования также показали, что индукция образования первичного каллуса у H. muticus зависела от гормонального состава питательной среды и типа экспланта.

При культивировании сегментов листа, стебля и корня на среде МС использовали отдельно БАП в концентрациях 1,0, 2,0 и 3,0 мг/л и БАП в сочетании с НУК: 0,5 мг/л БАП с 0,5, 1,0, 2,0 и 3,0 мг/л НУК, и 1,0, 2,0 и 3,0 мг/л БАП с 1,0 мг/л НУК.

В ходе исследования влияния гормонального состава питательной среды на процесс индукции каллусогенеза было испытано 11 модификаций стандартной среды МС, характеризующихся содержанием различных концентраций ауксина и цитокинина. Установлено, что на безгормональной питательной среде, а также при введении в состав среды только БАП не наблюдали индукции каллусогенеза из листовых и стеблевых эксплантов. На остальных исследуемых питательных средах на 35–40 дни наблюдали появление каллусной ткани.

В результате проведенных исследований было показано, что у эксплантов, полученных из сегментов листа, низкое образование каллуса наблюдали на среде МС, содержащей 0,5 мг/л БАП и 2,0 мг/л НУК (в среднем 13,64 мг/эксплант сырого каллуса и 0,48 мг/эксплант сухого каллуса) (табл. 1). Максимальное каллусообразование наблюдали при использовании 1,0 мг/л БАП в сочетании с 1,0 мг/л НУК. В среднем сырой и сухой вес каллуса составил 20,11 и 0,67 мг/эксплант соответственно.

Среда, содержащая 2,0 мг/л БАП в сочетании с 1,0 мг/л НУК, оказалась самой эффективной для индукции каллуса из стеблей H. muticus. Масса сырого и сухого каллуса составила 21,81 мг/эксплант и 0,90 мг/эксплант соответственно (табл. 2). Экспланты, культивировавшиеся на среде МС, дополненной 0,5 мг/л БАП в сочетании с 2,0 мг/л НУК, показали самое минимальное каллусообразование (в среднем 7,40 и 0,31 мг/эксплант сырого и сухого каллуса).

 

Таблица 1 – Влияние БАП и НУК на индукцию каллуса из листовых эксплантов H. muticus

Концентрация регуляторов роста, мг/л		Каллусообразование, %	Сырая биомасса каллуса, мг/эксплант	Сухая биомасса каллуса, мг/эксплант
БАП	НУК
0,0	0,0	0,00	0,00	0,00
1,0	0,0	0,00	0,00	0,00
2,0	0,0	0,00	0,00	0,00
3,0	0,0	0,00	0,00	0,00
0,5	0,5	100	15,28 ± 0,10	0,61 ± 0,05
0,5	1,0	100	14,08 ± 0,09	0,62 ± 0,03
0,5	2,0	100	13,64 ± 0,43	0,48 ± 0,05
0,5	3,0	100	15,19 ± 0,55	0,50 ± 0,09
1,0	1,0	100	20,11 ± 0,60	0,67 ± 0,07
2,0	1,0	100	14,58 ± 0,33	0,56 ± 0,05
3,0	1,0	100	17,07 ± 0,17	0,58 ± 0,03

 

Таблица 2 – Влияние БАП и НУК на индукцию каллуса из стеблевых эксплантов H. muticus

Концентрация регуляторов роста, мг/л		Каллусообразование, %	Сырая биомасса каллуса, мг/эксплант	Сухая биомасса каллуса, мг/эксплант
БАП	НУК
0,0	0,0	0,00	0,00	0,00
1,0	0,0	0,00	0,00	0,00
2,0	0,0	0,00	0,00	0,00
3,0	0,0	0,00	0,00	0,00
0,5	0,5	100	16,27 ± 0,43	0,64 ± 0,04
0,5	1,0	100	12,30 ± 1,54	0,40 ± 0,09
0,5	2,0	100	7,40 ± 0,48	0,31 ± 0,06
0,5	3,0	100	13,84 ± 1,24	0,49 ± 0,09
1,0	1,0	100	12,54 ± 0,63	0,40 ± 0,09
2,0	1,0	100	21,81 ± 0,94	0,90 ± 0,07
3,0	1,0	100	8,10 ± 0,28	0,25 ± 0,05

 

Индукция каллусогенеза из корневых эксплантов H. muticus, как видно из полученных данных (табл. 3), наблюдалась на среде, содержащей отдельно БАП и БАП в сочетании с НУК, тогда как на безгормональной среде каллус не образовывался.

При этом минимальное каллусообразование из корневых эксплантов наблюдали на среде МС, содержащей только БАП. У эксплантов, культивировавшихся на среде МС, дополненной 0,5 мг/л БАП в сочетании с 1,0 мг/л НУК, отмечали максимальное образование сырой (31,56 мг/эксплант) и сухой (1,04 мг/эксплант) биомассы.

Во многих научных исследованиях показано, что ауксины и цитокинины оказывают значительное влияние на индукцию каллуса, тогда как безгормональная среда МС, не оказывает положительного влияния на каллусообразование у большинства растений семейства Solanaceae [10, p. 874–882; 11, p. 382–392; 12, p. 1236–1242; 13, p. 1858–1866; 14, p. 40–46; 15, p. 47–50]. В работах [16, p. 38–44], показано, что самый высокий процент индукции каллуса из листовых эксплантов Physalis minima Linn. наблюдали на среде МС, содержащая 2,4-Д (90%), НУК (70%) и ИУК (50%). Отмечено, что питательная среда МС, содержащая БАП в сочетании с НУК, наиболее эффективна для индукции каллуса из листовых эксплантов H. niger L. и Datura metal [13, p. 1858–1866]. Самый высокий процент индукции каллуса наблюдали на среде МС, содержащая БАП в сочетании с НУК из листовых эксплантов Solanum nigrum L. [17, p. 99–103], Withania somnifera L. [18, p. 58–61], Stevia rebaudiana [19, p. 56–60], Biophytum sensitivum [20, p. 127–131].

 

Таблица 3 – Влияние БАП и НУК на индукцию каллуса из корневых эксплантов H. muticus

Концентрация регуляторов роста, мг/л		Каллусообразование, %	Сырая биомасса каллуса, мг/эксплант	Сухая биомасса каллуса, мг/эксплант
БАП	НУК
0,0	0,0	0,00	0,00	0,00
1,0	0,0	80	2,13 ± 0,75	0,12 ± 0,03
2,0	0,0	100	6,88 ± 0,74	0,24 ± 0,03
3,0	0,0	73,34	1,47 ± 0,35	0,08 ± 0,03
0,5	0,5	100	28,48 ± 1,12	0,79 ± 0,08
0,5	1,0	100	31,56 ± 1,07	1,04 ± 0,04
0,5	2,0	100	13,52 ± 0,49	0,34 ± 0,04
0,5	3,0	100	18,04 ± 0,67	0,55 ± 0,04
1,0	1,0	100	24,50 ± 0,64	0,73 ± 0,06
2,0	1,0	100	19,04 ± 0,86	0,52 ± 0,06
3,0	1,0	100	14,79 ± 0,50	0,50 ± 0,02

 

Тем не менее, каллусная ткань в наших исследованиях лучше всего формировалась на сегментах корней, тогда как на листовых и стеблевых эксплантах наблюдали лишь единичное образование длительно культивируемого каллуса, способного к дальнейшей пролиферации (рис. 1). Через 5 недель вследствие интенсивной пролиферации, каллусные культуры, полученные из корневых эксплантов, характеризовались следующими морфологическими особенностями: однородные, рыхлые, оводненные каллусы от светло-бежевого до светло-зеленого цвета, иногда с бурыми участками.

 

Рисунок 1 – Каллусообразование из корневых эксплантов на среде МС, дополненной 0,5 мг/л БАП в сочетании с 1,0 мг/л НУК

 

Таким образом, проведенные экспериментальные исследования показали, что индукция образования и интенсивность роста каллусной ткани H. muticus in vitro зависела от регуляторов роста и типа экспланта. Максимальное каллусообразование получено из корневых эксплантов в отличие от листовых и стеблевых сегментов. При этом следует отметить, что в питательной среде необходимо наличие регуляторов роста как цитокининовой, так и ауксиновой природы.

About the authors

Walla Abdelmaksood Abdelazeez

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: wallamohamed68@gmail.com

postgraduate student of Botany and Plant Physiology Department

Russian Federation, Kazan

Landysh Zavdetovna Khusnetdinova

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: husnetdinova.l@mail.ru

candidate of biological sciences, associate professor of Botany and Plant Physiology Department

Russian Federation, Kazan

Olga Arnoldovna Timofeeva

Kazan (Volga Region) Federal University

Author for correspondence.
Email: olga.timofeeva@kpfu.ru

doctor of biological sciences, professor of Botany and Plant Physiology Department

Russian Federation, Kazan

References

Supplementary files