Preliminary results of spectrophotometric screening of secondary metabolites accumulation in lichen thalloms

Full Text

Лишайники как специфическая форма симбиотических организмов, сформированная взаимодействием гриба (микобионт) и фотосинтетического партнера (фикобионт, в качестве которого выступают водоросли либо цианобактерии), представлены в различных типах экосистем более чем 20 000 идентифицированных видов [1; 2]. Они являются распространенным компонентом природных и антропогенно трансформированных экосистем, обитают на коре, стволах и листьях деревьев, почве, а также осваивают местообитания, малопригодные для высших растений [3]. Для Самарской области видовое разнообразие лишайников, по настоящим оценкам, определяется показателем свыше 350 [4]. При этом частота встречаемости отдельных видов неодинакова – при наличии исключительно редких таксонов [5] встречаются и повсеместно распространенные в различных типах лесонасаждений. Для последних, характеризующихся значительной экологической пластичностью, интересным моментом представляется способность адаптироваться к условиям местообитания, в том числе изменять метаболическую активность, синтезируя вторичные метаболиты.

Вторичные соединения, которые считаются не участвующими непосредственно в основном обмене веществ, обнаружены у тысяч видов высших растений, различных групп животных, грибов [6]. Только в растениях идентифицировано более 100 тыс. индивидуальных соединений вторичного метаболизма, ежегодно к ним добавляются десятки новых [7]. Вторичные соединения, значение которых обнаруживается на уровне организма, но не клетки, участвуют в осуществлении различных экологических функций в качестве хемоэффекторов.

Вторичные метаболиты лишайников, формируемые микобионтом, относятся к различным классам соединений, в том числе – депсидам, депсидонам, дибензофуранам, ксантонам, производным терпенов и пр. [8; 9]. Как и у высших растений, в талломах лишайников высоким разнообразием характеризуется группа фенольных соединений, специфичных для микобионта многих видов лишайников и не свойственных другим организмам [10]. Наиболее распространенными среди них считаются усниновая кислота, депсиды, депсидоны и антрахиноны. В структуре депсидов и депсидонов обнаружены фрагменты полизамещенных фенолов или фенолкарбоновых кислот, находящихся в различных комбинациях. Большинство лишайниковых веществ нерастворимо или слаборастворимо в воде [11]. Кроме того, лишайники являются источником ферментов, полисахаридов, жирных кислот, обладающих значительным фармакологическим потенциалом [11; 12]. Лишайниковые вещества обнаруживают широкий спектр биологических эффектов, включая антибиотические, антимитотические, противовирусные, противовоспалительные, обездоливающие, жаропонижающие, антипролиферативные и цитотоксические [13–15]. На долю вторичных соединений в талломах лишайников может приходиться до 5% [16], по другим источникам – до 20% сухой массы [17]. Сведения о числе идентифицированных лишайниковых вторичных метаболитов неоднозначны, в силу их продолжающегося изучения.

Вопрос о влиянии биотопических условий на синтез и накопление вторичных метаболитов лишайников активно разрабатывается. Имеются сведения о зависимости накопления органических метаболитов в лишайниках от различных абиотических факторов среды: освещенности, температуры, влажности [18; 19], а также от комплекса биотопических условий. Так, для Центральной Якутии было показано, что содержание лишайниковых кислот в талломах лишайников зависело от типа соснового леса, в котором они были отобраны [20]. Установленные различия, по мнению авторов, могут объясняться как действием абиотических факторов среды (свет, температура, влажность), так и конкуренцией со стороны других видов растений. Для условий лесостепи-степи, в том числе Самарской области, вопрос о влиянии биотопа на накопление вторичных метаболитов лишайниками нельзя считать изученным. Данная работа представляет полученные нами предварительные итоги спектрофотометрического скрининга вторичных метаболитов в талломах лишайников Xanthoria parietina (L.) Belt., Parmelia sulcata Tayl., Vulpicida pinastri (Scop.) J.-E. Mattsson & M.J. Lai., распространенных в лесных экосистемах Самарской области.

Материалы и методы исследований

Пробы талломов лишайников трех видов – Xanthoria parietina (L.) Belt., Parmelia sulcata Tayl., Vulpicida pinastri (Scop.) J.-E. Mattsson & M.J. Lai были отобраны в летний период 2016 г. в Красносамарском лесном массиве (долина р. Самары, Кинельский р-н Самарской области) на 9 пробных площадях, растительные сообщества которых представляли собой фрагменты естественных лесов – березняков (пробные площади 24, 8б), осинников (пробные площади 8, 21), липняков (пробные площади 8а, 6а), дубрав (пробные площади 20, 25) и одного искусственного ельника (пробные площади е1). Названные сообщества различались по биотопическим условиям: положению в рельефе, составу древесного яруса, связанным с высотой и сомкнутостью насаждений микроклиматическим условиям (освещенностью, влажностью воздуха и пр.). Образцы талломов лишайников снимали со стволов с верхним слоем коры и помещали в этикетированные бумажные пакетики. В лабораторных условиях восходящие лопасти таллома отделяли от субстрата и от его фрагментов, высушивали до воздушно-сухого состояния, измельчали вручную до частиц размером 1–3 мм. Навески по 20 мг подготовленного материала экстрагировали 10 мл 96% этанола путем настаивания при комнатной температуре в темноте в течение 2 недель. Полученные экстракты сливали путем декантации и анализировали с использованием детектора AZURA UV/VIS UVD 2.1 L (190–750 нм, Knauer) в лаборатории кафедры химии Самарского университета для получения спектров поглощения в УФ-области с помощью программы ClarityChrom. Пробы объемом 20 мкл вводили непосредственно в ячейку детектора прибора. Полученные результаты анализировали, используя пакет Excel.

Результаты и их обсуждение

В изучении вторичных метаболитов лишайников широко используются современные инструментальные аналитические методы, в том числе хроматография и спектрофотометрия. Физической основой спектрофотометрического определения веществ является избирательное поглощение их растворами монохроматического света, а само поглощение обусловливается электронными переходами с орбиты донорного заместителя на вакантную орбиту бензольного кольца или акцепторного заместителя [21]. Распространенные среди вторичных метаболитов фенольные соединения характеризуются наличием в УФ-области спектра двух интенсивных полос поглощения в длинноволновой области: для флавоноидов 320–380 нм (I полоса) и в коротковолновой 240–270 нм (II полоса), для флавонолов 350–390 нм и 250–270 нм соответственно, дополнительный максимум при 300 нм. Другие источники указывают для флавоноидов в УФ–спектре характерные них максимумы поглощения в областях 250–270 нм и 330–370 нм [22–24]. На данном этапе нашего исследования было принципиально важно получить ответ на вопрос: имеются ли количественные либо качественные различия в накоплении вторичных метаболитов талломами лишайников в зависимости от видовой принадлежности и/или биотопических условий произрастания. Для получения ответа в качестве метода скрининга было избрано спектрофотометрическое сканирование экстрактов без предварительного разделения, которое позволило нам оперативно получить необходимую информацию. Показания прибора, относящиеся к результатам изучения каждого из трех видов лишайников для образцов, собранных в разных лесных биотопах, были использованы для построения спектров, которые мы для удобства разделили на две спектральные области (рис. 1, 2).

Для спектральной области 250–350 нм, в которой предположительно могли быть обнаружены два названных выше максимума поглощения, соответствующие фенольным соединениям, три изучаемых вида лишайников обнаружили разную картину спектров и продемонстрировали заметные особенности для экстрактов из различных лесных биотопов. Так, для спиртовых экстрактов из талломов Xanthoria и Vulpicida мы отметили неодинаковую выраженность пиков в областях 250–290 и 290–330 нм – от максимальной выраженности (Кс20) до практического отсутствия (Кс24), а также в области 290–330 нм.

 

Рисунок 1 – Сравнение спектров поглощения спиртовых экстрактов из талломов лишайников, собранных в различных биотопических условиях Красносамарского леса (спектральная область 250–350 нм)

 

Рисунок 2 – Сравнение спектров поглощения спиртовых экстрактов из талломов лишайников, собранных в различных биотопических условиях Красносамарского леса (спектральная область 350–500 нм)

 

В целом же, анализируя особенности картины спектров для трех изучавшихся видов, мы можем указать, что в области 250–350 нм экстракты Parmelia sulcata обнаруживали исключительно количественные различия по выраженности (высоте) кривых, что можно интерпретировать как различный уровень накопления одних и тех же соединений. Для Xanthoria parietina различия затрагивали и качественный состав, и уровень накопления вторичных метаболитов. У Vulpicida pinastri один из всех проанализированных экстрактов отличался по картине спектра, имея выраженный пик с максимумом 263 нм, все прочие отличались количественно (по высоте кривых). В области 350–500 нм экстракты трех изучавшихся лишайников демонстрировали исключительно количественные различия, которые были максимально выражены у Xanthoria, минимально – у Parmelia.

Таким образом, на данном этапе исследования для произрастающих в лесных сообществах в степной зоне лишайников Xanthoria parietina, Parmelia sulcata и Vulpicida pinastri с помощью спектрофотометрического скрининга спиртовых экстрактов подтверждена способность изменять накопление вторичных метаболитов в зависимости от тонких биотопических различий местообитания. Мы предполагаем, что в первую очередь подобными действующими факторами могут являться флуктуирующие уровни освещенности и влажности, и в дальнейшем проверим данное предположение, сопоставляя данные скрининга с детальной многофакторной оценкой биотопических условий произрастания тестируемых лишайников.

About the authors

Maria Vladimirovna Gorina

Samara National Research University

Email: gorina.mariya2011@yandex.ru

postgraduate student of Ecology, Botany and Nature Protection Department

Russian Federation, Samara

Lyudmila Mikhailovna Kavelenova

Samara National Research University

Author for correspondence.
Email: lkavelenova@mail.ru

doctor of biological sciences, professor, head of Ecology, Botany and Nature Protection Department

Russian Federation, Samara

Svetlana Alexandrovna Platonova

Samara National Research University

Email: svetlanrychkov@yandex.ru

assistant of Chemistry Department

Russian Federation, Samara

References

Supplementary files