Email this article 
The effect of short-term cold exposure on the change in the concentration of free proline in various birch species in vitro
- Authors: Vnukova N.I.1
-
Affiliations:
- All-Russian Research Institute of Forest Genetics, Breeding and Biotechnology
- Issue: Vol 12, No 1 (2023)
- Pages: 38-42
- Section: Biological Sciences
- URL: https://snv63.ru/2309-4370/article/view/516348
- DOI: https://doi.org/10.55355/snv2023121106
- ID: 516348
Cite item
Full Text
Abstract
In natural conditions of growth, forest woody plants constantly face negative environmental factors. Environmentally unfavorable impacts certainly affect the physiological and biochemical processes occurring in plants and lead to the activation of their own protective mechanisms. In recent years, methods of biotechnology (cell and tissue selection) have been increasingly used in the study of adaptive capabilities, as well as the degree of tolerance of plants to abiotic stress factors. In our work, we evaluated the specifics of the reaction of Betula pendula Roth, Betula pendula Roth var. carelica (Mercklin) L. Hämet-Ahti and Betula pubescens Ehrh. in vitro, in particular the change in the level of free proline to low-temperature stress (+4°C) of different duration times. It was found that the highest value of the amino acid content in relation to the control was in the Betula pendula Roth var. carelica Merckl. clones and ranged from 163 to 206%, in the Betula pubescens Ehrh. and Betula pendula Roth clones ranged from 103 to 128% and from 101 to 131%, respectively. Uniformity was noted among the clones of Betula pendula Roth var. carelica Merckl. according to the degree of response to stress. The relationship between the ability of plants to produce more proline and successful adaptation to cold shock was revealed.
Full Text
Введение
Как известно, в клетках растений постоянно образуются активные формы кислорода (АФК), содержание которых благодаря работе специальных систем в норме поддерживается на низком уровне. Однако под действием неблагоприятных факторов, таких как избыточное загрязнение ионами некоторых металлов (Fe, Cu, Ni, Cd, Mn, Co, Zn) или засоление (хлоридами, сульфатами, карбонатами) почвы, ультрафиолетовое излучение, гипо- и гипертермия, чрезмерная влажность или засуха, недостаток питательных веществ и других, происходит усиление генерации имеющих высокую химическую активность АФК и в клетках растений развивается окислительный стресс [1–6] Для предотвращения неблагоприятных последствий у растений активизируется собственная антиоксидантная защитная система (АОС), состоящая из антиоксидантных ферментов, низкомолекулярных соединений, макромолекулярных неферментативных компонентов, способная в определенной мере нейтрализовать свободные радикалы [1; 7–9]. Изменение содержания различных составляющих АОС в момент стресса по отношению к нормальным условиям позволяет оценивать уровень толерантности конкретных видов растений к тому или иному повреждающему фактору. Одним из индикаторов физиологического состояния растений в условиях стресса, а также степени устойчивости к неблагоприятным воздействиям, является низкомолекулярный антиоксидант пролин [10; 11]. Согласно литературным данным, эта аминокислота принимает участие во многих процессах развития растений, вносит свой вклад в ответ на абиотический стресс (защищает белки от денатурации, регулирует осмотическое давление, поддерживает низкий уровень токсичных ионов, образует со свободными радикалами долгоживущие конъюгаты и др.) [12–15]. Уникальным свойством пролина является саморегуляция активности энзимов своего синтеза/деградации, что позволяет рассматривать его как сигнально-регуляторную молекулу в условиях адаптации растений к стрессу [13; 16–18]. Под действием экстремальных условий в тканях растений происходит, как правило, интенсивное накопления пролина [19–24]. В рамках долгосрочного стресса гомеостаз аминокислоты очень важен для поддержания устойчивого роста активно делящихся клеток [25]. При этом относительный вклад протекторной, осморегуляторной и других функций пролина может изменяться в онтогенезе и определяться природой стрессора, интенсивностью и продолжительностью его действия [26]. Таким образом, накопленная информация свидетельствует о возможности использования данного показателя в качестве тестового для выявления стрессовой реакции растений и оценки степени их устойчивости к различным негативным воздействиям окружающей среды.
Цель данной работы состояла в изучении влияния пониженной температуры (+4°C) на изменение уровня пролина у микрорастений различных клонов берёзы in vitro, а также установлении возможной связи между способностью к интенсивному накоплению аминокислоты и устойчивостью клонов к экстремальным условиям.
Материалы и методы
Исследования проводились на растениях-регенерантах in vitro берёзы карельской (B. pendula Roth var. carelica (Mercklin) L. Hämet-Ahti): клоны Ia, Ю, Ап, 18к, Тр; пушистой (B. pubescens Ehrh.): клоны 1пш, 2пш, 3пш, 6пш, 7гб; повислой (B. pendula Roth): клоны ПВ1, д.5 из коллекции in vitro ФГБУ ВНИИЛГИСбиотех (г. Воронеж).
Микропобеги хранились в стандартных условиях культуральной нормы (температура +25 ± 2°C, интенсивность света 2,0 клк, 16-часовой фотопериод) на среде Мурасиге–Скуга с половинным содержанием макроэлементов (½ MS) с повышенным содержанием аскорбиновой кислоты (2,0 мг/л вместо 0,5 мг/л в норме) [27]. В опытных вариантах культуры на 23-е и 26-е сутки помещались в холодильную камеру (температура +4 ± 1°C, интенсивность света 0,5 клк, 6-часовой фотопериод) и выдерживались в этих условиях 4 или 7 суток соответственно, тогда как в контроле растения продолжали расти в микроклимате растильни. Через 30 суток после начала пассажа осуществлялся забор биоматериала в одно и то же время – с 8 до 9 часов утра, в период наибольшего синтеза аминокислоты у растений, и определение уровня пролина в листьях регенерантов.
Определение свободного пролина в листьях растений проводили с помощью кислого нингидринового реактива по методу Bates с модификациями с учетом специфики объектов исследования [28; 29; 23]. Калибровочную кривую строили по кристаллическому L-пролину (99%, Panreac). Концентрацию свободного пролина в образцах листьев рассчитывали в мкмоль/г свежей массы. Каждый эксперимент проводился в трехкратной повторности. Для всех клонов берёзы приведены усредненные значения содержания свободного пролина. Достоверность различий оценивали по критерию Стъюдента.
Результаты исследования и их обсуждение
На диаграмме (рис. 1) представлены результаты измерения содержания свободного пролина у контрольных и опытных образцов после 4-суточного холодового воздействия (+4°C). Как видно из данных, все клоны отреагировали на стресс возрастанием уровня аминокислоты, но в разной степени. В ходе наших исследований обнаружено достоверное увеличение содержания пролина (Р < 0,001) у опытных микрорастений клонов берёзы карельской – значение по отношению к контролю варьировало в пределах от 163 до 206% (табл. 1).
Рисунок 1 – Изменение содержания свободного пролина у различных клонов берёзы in vitro в результате холодового стресса (+4°C) в течение 4 суток
Таблица 1 – Влияние температуры +4°C на изменение свободного пролина в листьях регенерантов разных клонов берёзы в зависимости от времени пребывания в условиях низкотемпературного стресса
Клон | Содержание пролина | |||||||
контроль | 4 суток в холодильнике | отн. контроля, % | контроль | 7 суток в холодильнике | отн. контроля, % | |||
абс. величина, мкмоль/г с.м. | абс. величина, мкмоль/г с.м. | |||||||
Берёза карельская | ||||||||
Ю | 5,4 ± 0,29 | 8,8 ± 0,36* | 162,9 | 6,4 ± 0,93 | 13,0 ± 1,10* | 203,1 | ||
Ia | 3,7 ± 0,51 | 7,1 ± 0,46* | 191,9 | 4,5 ± 0,34 | 9,5 ± 0,79* | 211,1 | ||
Ап | 4,9 ± 0,54 | 8,7 ± 0,37* | 177,6 | 3,9 ± 0,53 | 7,6 ± 0,87* | 194,8 | ||
18к | 4,6 ± 0,69 | 7,9 ± 0,30* | 171,7 | 4,0 ± 0,40 | 7,8 ± 0,10* | 195,0 | ||
Тр | 3,1 ± 0,21 | 6,4 ± 0,68* | 206,4 | 3,1 ± 0,18 | 6,4 ± 0,65* | 206,5 | ||
Среднее | 4,3 ± 0,42 | 7,8 ± 0,39* | 181,4 | 4,4 ± 0,46 | 8,9 ± 0,51* | 202,3 | ||
Берёза пушистая | ||||||||
1пш | 7,4 ± 0,67 | 7,8 ± 0,78 | 105,4 | 7,1 ± 0,24 | 8,0 ± 0,85 | 112,7 | ||
2пш | 5,5 ± 0,73 | 6,9 ± 0,83 | 125,0 | 6,0 ± 0,18 | 7,0 ± 0,80 | 116,7 | ||
3пш | 5,4 ± 0,37 | 6,5 ± 0,01 | 120,4 | 4,6 ± 0,41 | 5,8 ± 0,90 | 126,1 | ||
6пш | 4,6 ± 0,45 | 5,5 ± 0,50 | 119,6 | 4,7 ± 0,44 | 6,0 ± 0,42 | 127,7 | ||
7гб | 6,8 ± 0,90 | 8,3 ± 0,36 | 122,1 | 5,1 ± 1,10 | 6,1 ± 0,86 | 119,6 | ||
Среднее | 6,0 ± 0,53 | 7,0 ± 0,49 | 116,7 | 5,5 ± 0,38 | 6,5 ± 0,68 | 118,2 | ||
Берёза повислая | ||||||||
ПВ1 | 4,5 ± 0,51 | 5,6 ± 0,69 | 124,4 | 4,9 ± 0,65 | 6,4 ± 0,59 | 130,6 | ||
д.5 | 15,4 ± 0,47 | 17,0 ± 0,70 | 110,4 | 14,5 ± 0,61 | 14,7 ± 0,76 | 101,4 | ||
Среднее | 10,0 ± 0,50 | 11,3 ± 0,69 | 113,6 | 9,7 ± 0,62 | 10,6 ± 0,65 | 109,3 | ||
Примечание. * – различия с контролем статистически значимы при Р < 0,001.
У остальных видов берёзы увеличение содержания пролина в ответ на стресс не превышало 25% и колебалось: у пушистой – от 105 до 125%, у повислой – от 110 до 124%. Обращает на себя внимание высокое абсолютное значение аминокислоты у клона д.5 в контроле, что говорит о его относительной нестабильности in vitro. И действительно, у этого клона есть трудности с укоренением (ризогенез в 80%), развитие микрочеренков происходит медленнее, средняя высота побегов стабильно меньше, чем у других клонов.
В следующей серии опытов экспериментальные микрочеренки помещали в условия холодового шока (+4°C) на более длительный период, 7 суток. Из таблицы 1 и рисунка 2 видно, что для большинства клонов берёзы карельской по сравнению с 4-суточным нахождением культур в холодильной камере наблюдается возрастание уровня пролина по отношению к контролю (до 195–211%) и только у клона Тр этот показатель практически не изменился (206% в обоих случаях). Также отмечена внутривидовая однородность стресс-реакции клонов карельской берёзы.
Рисунок 2 – Изменение содержания свободного пролина у различных клонов берёзы in vitro в результате холодового стресса (+4°C) в течение 7 суток
Более длительное пребывание культур в условиях низкой температуры для клонов берёзы пушистой привело к незначительному, относительно 4-суточного, либо увеличению концентрации пролина (до 10%) – клоны 1пш, 3пш, 6пш, либо уменьшению (до 8%) – клоны 2пш, 7гб. В итоге у опытных образцов по сравнению с контролем содержание аминокислоты повысилось не более, чем на 30%. Наибольшие внутриклоновые различия через неделю эксперимента были отмечены у клонов берёзы повислой: уровень пролина у д.5 в опыте и контроле отличался на 1%, а у ПВ1 – на 31%.
Полученные данные хорошо согласуются с многолетними (2015–2022 гг.) наблюдениями за депонированием этих клонов в условиях длительного низкотемпературного воздействия (+4°C, 12 месяцев) [30]. После окончания срока хранения in vitro растения карельской берёзы возобновляли рост в 70–100% случаев. У берёзы пушистой в зависимости от клона погибали от 30 до 70% растений. У д.5 в разные годы выживали 35–50% микрочеренков, а у ПВ1 после года хранения сохранялись и развивались от 50 до 65% культур (клоны берёзы повислой).
Заключение
Таким образом, установлена корреляция между уровнем свободного пролина и выживаемостью микрочеренков берёзы in vitro после действия низкой положительной температуры. Очевидно, что способность растений продуцировать большее количество свободного пролина в стрессовых условиях среды способствует успешной адаптации к холодовому шоку и сохранению в дальнейшем высокого регенерационного потенциала. Интенсивность синтеза аминокислоты, а следовательно, и устойчивость к стресс-факторам, зависит от генотипических особенностей клонов. Так, например, при холодовом воздействии (+4°C) в течение 7 дней содержание пролина у микрочеренков берёзы карельской возрастало по сравнению с контролем в среднем в 2 раза, у остальных видов берёзы (повислой, пушистой) не более, чем в 1,3 раза. Полученные ранее результаты по отбору генотипов берёзы, устойчивых к длительному низкотемпературному воздействию (+4°C, 1 год), подтверждают сделанные нами выводы: выживаемость у большинства клонов карельской берёзы по окончании срока депонирования в холодильнике приближалась к 100%, а у клонов других видов берёзы составляла 30–70%.
About the authors
Natalya Ivanovna Vnukova
All-Russian Research Institute of Forest Genetics, Breeding and Biotechnology
Author for correspondence.
Email: natalya.vnuckova@yandex.ru
researcher of Forest Genetics and Biotechnology Department
Russian Federation, VoronezhReferences
- Лукаткин А.С. Холодовое повреждение теплолюбивых растений и окислительный стресс. Саранск: Изд-во Мордовского ун-та, 2002. 208 с.
- Janda T., Szalai G., Rios-Ganzalez K., Veisz O., Paldi E. Comparative study of frost tolerance and antioxidant activity in cereals // Plant Science. 2003. Vol. 164, iss. 2. P. 301–306. doi: 10.1016/s0168-9452(02)00414-4.
- Казнина Н.М., Батова Ю.В., Титов А.Ф., Лайдинен Г.Ф. Роль отдельных компонентов антиоксидантной системы в адаптации растений Elytrigia repens (L.) Nevski к кадмию // Труды Карельского научного центра Российской академии наук. 2016. № 11. С. 17–26. doi: 10.17076/eb365.
- Sharma P., Jha A.B., Dubey R.S., Pessarakli M. Reactive oxygen species, oxidative damage, and antioxidative defense mechanism in plants under stressful conditions // Journal of Botany. 2012. Vol. 2012. doi: 10.1155/2012/217037.
- Miller G., Suzuki N., Ciftci-Yilmaz S., Mittler R. Reactive oxygen species homeostasis and signalling during drought and salinity stresses // Plant, Cell and Environment. 2010. Vol. 33, iss. 4. P. 453–467. doi: 10.1111/j.1365-3040.2009.02041.x.
- Blokhina O., Virolainen E., Fagerstedt K.V. Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress: a review // Annals of Botany. 2003. Vol. 91, iss. 2. P. 179–194. doi: 10.1093/aob/mcf118.
- Радюкина Н.Л. Функционирование компонентов антиоксидантной системы дикорастущих видов растений при кратковременном действии стрессоров: дис. … д-ра биол. наук: 03.01.05. М., 2015. 207 с.
- Терлецкая Н.В. Неспецифические реакции зерновых злаков на абиотические стрессы in vivo и in vitro. Алматы, 2012. 208 с.
- Игнатенко А.А. Участие антиоксидантной системы в регуляции холодоустойчивости растений пшеницы и огурца салициловой кислотой и метилжасмонатом: дис. … канд. биол. наук: 03.01.05. Петрозаводск, 2019. 191 с.
- de Carvalho K., de Campos M.K.F., Domingues D.S., Pereira L.F.P, Vieira L.G.E. The accumulation of endogenous proline induces changes in gene expression of several antioxidant enzymes in leaves of transgenic Swingle citrumelo // Molecular Biology Reports. 2013. Vol. 40, iss. 4. P. 3269–3279. doi: 10.1007/s11033-012-2402-5.
- Saradhi P.P., Arora A.S., Prasad K.V.S.K. Proline accumulates in plants exposed to UV radiation and protects them against UV induced peroxidation // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1995. Vol. 209, iss. 1. P. 1–5. doi: 10.1006/bbrc.1995.1461.
- Кузнецов Вл.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция // Физиология растений. 1999. Т. 46, № 2. С. 321–336.
- Szabados L., Savoure A. Proline: a multifunctional amino acid // Trends in Plant Science. 2010. Vol. 15, iss. 2. P. 89–97. doi: 10.1016/j.tplants.2009.11.009.
- Liang X., Zhang L., Natarajan S.K., Becker D.F. Proline mechanisms of stress survival // Antioxidants & Redox Signaling. 2013. Vol. 19, № 9. P. 998–1011. doi: 10.1089/ars.2012.5074.
- Колупаев Ю.Е., Горелова Е.И., Ястреб Т.О. Механизмы адаптации растений к гипотермии: роль антиоксидантной системы // Вестник Харьковского национального аграрного университета. Серия Биология. 2018. Вып. 1 (43). С. 6–33.
- Lehmann S., Funck D., Szabados L., Rentsch D. Proline metabolism and transport in plant development // Amino Acids. 2010. Vol. 39. P. 949–962. doi: 10.1007/s00726-010-0525-3.
- Кривобочек В.Г., Стаценко А.П., Тразанова Е.А., Курышев И.А. Свободный пролин – биохимический показатель солеустойчивости растений // Аграрный научный журнал. 2017. № 1. С. 16–19.
- Хабиева Н.А., Куркиев К.У. Морфо-физиологические изменения у проростков озимой тритикале (Triticosecale) в условиях хлоридного засоления // Успехи современной науки. 2017. Т. 2, № 10. С. 144–148.
- Сергеева Л.Е., Бронникова Л.И., Тищенко Е.Н. Содержание свободного пролина как показатель жизнедеятельности клеточной культуры Nicotiana tabacum L. при стрессе // Биотехнология. 2011. Т. 4, № 4. С. 87–94.
- Данилова Е.Д., Медведева Ю.В., Ефимова М.В. Влияние хлоридного засоления на ростовые и физиологические процессы растений Solanum tuberosum L. среднеспелых сортов // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2018. № 44. С. 158–171. doi: 10.17223/19988591/44/9.
- Шерудило Е.Г., Сысоева М.И., Илюха В.А. Реакция антиоксидантной системы растений огурца на постоянное и кратковременное периодическое действие низкой температуры // Труды Карельского научного центра Российской академии наук. 2013. № 3. С. 166–172.
- Землянухина О.А., Калаев В.Н., Воронина В.С., Мирошниченко Л.А. Влияние абиотического стресса на содержание свободного пролина у микроклонов вейгелы цветущей «вариегата» (Weigela florida «Variegata») // Проблемы региональной экологии. 2016. № 6. С. 6–13.
- Внукова Н.И. Изменение содержания пролина у микрорастений берёзы in vitro как ответная реакция на хлоридное засоление питательной среды // ФГБУ «ВНИИЛГИСбиотех» – Наука и практика. М.: Перо, 2021. С. 35–40.
- Табацкая Т.М., Внукова Н.И., Машкина О.С. Ответные реакции берёзы на воздействие кадмия в условиях in vitro // Труды Санкт-Петербургского научно-исследовательского института лесного хозяйства. 2022. № 3. С. 25–37.
- Fichman Y., Gerdes S.Y., Kovacs H., Szabados L., Zilberstein A., Csonka L.N. Evolution of proline biosynthesis: enzymology, bioinformatics, genetics, and transcriptional regulation // Biological Reviews. 2015. Vol. 90, iss. 4. P. 1065–1099. doi: 10.1111/brv.12146.
- Serraj R., Sinclair T.R. Osmolyte accumulation: can it really help increase crop yield under drought conditions? // Plant, Cell & Environment. 2002. Vol. 25, iss. 2. P. 333–341. doi: 10.1046/j.1365-3040.2002.00754.x.
- Машкина О.С., Табацкая Т.М., Внукова Н.И. Способ длительного хранения in vitro микрорастений берёзы: патент на изобретение RU 2634409. 03.10.2016.
- Bates L.S., Waldren R.P., Teare I.D. Rapid determination of free proline for water-stress studies // Plant and Soil. 1973. Vol. 39, № 1. P. 205–207. doi: 10.1007/bf00018060.
- Шихалеева Г.Н., Будняк А.К., Шихалеев И.И., Иващенко О.Л. Модифицированная методика определения пролина в растительных объектах // Вестник Харьковского национального университета имени В.Н. Каразина. 2014. Вып. 21, № 1112. С. 168–172.
- Внукова Н.И. Отбор устойчивых к длительному низкотемпературному воздействию клонов берёзы in vitro // ФГБУ «ВНИИЛГИСбиотех» – Наука и практика. М.: Перо, 2021. С. 25–34.
Supplementary files
