The development of an adaptive response of Drosophila melanogaster to genotoxicity of alkyl(aryl)sulfurnyl 1,2,4-triazoles

Full Text

Введение

Накопление в популяциях генов, позволяющих развить резистентность к тем или иным ксенобиотиками, с которыми встречается вид в процессе своего существования, является единственным способом выживания организмов в условиях возрастающей антропогенной нагрузки на природные экосистемы. Ферменты, отвечающие за метаболизм каких-либо ксенобиотиков, в разной степени представлены у видов, контактирующих с антропогенными поллютантами. Обычно при исследовании анализируют наличие аллелей, продукты которых в той или иной степени эффективны в процессе утилизации организмом ксенобиотиков. В настоящее время такого рода генетические системы изучены у многих прокариот и эукариот [1, с. 187–188; 2, с. 34; 3, с. 279, 293, 299; 4, с. 72–75; 5, p. 5857; 6, p. 357–359].

Показателем слабой приспособленности популяции является медленное возрастание числа организмов, устойчивых к мутагенному действию ксенобиотиков, однако постоянное использование антропогенных ксенобиотиков, например, в сельском хозяйстве, ускоряет процессы адаптациогенеза. В настоящее время ведутся исследования механизмов возникновения устойчивости как на организменном, так и на популяционном уровне. Мало исследован вопрос, касающийся роли структуры химического агента в развитии адаптивного ответа. Исследования такого рода немногочисленны и, как правило, проводятся на микроорганизмах. Между тем понимание роли структуры вещества в развитии приспособленности к нему позволит понять эволюционный механизм появления организмов, адаптивных к антропогенным ксенобиотикам как среди патогенных прокариот, так и эукариот, являющихся вредителями сельскохозяйственных культур.

Особый интерес в поисках закономерностей устойчивости представляют собой исследования с использованием соединений, широко используемых человеком как в сельском хозяйстве, в качестве различных пестицидов, так и в фармакологии, например, производных триазола [7, с. 626–630; 8, p. 963–968; 9; 10, p. 1067–1078].

Известно, что избирательность многих из них недостаточна и, следовательно, они могут вызывать негативные последствия при контакте организмов с этими соединениями. Наиболее опасны отдалённые действия таких препаратов, проявляющиеся в виде различного рода летальных или сублетальных мутаций. Это снижает плодовитость и увеличивает гибель потомства, носителей таких мутаций. Следовательно, поиски связи между физико-химическими свойствами синтетических препаратов и их способностью индуцировать летальные мутации, а также способности организмов приспосабливаться к их мутагенности помогут понять процессы накопления полезных мутаций в природных популяциях, контактирующих с синтетическими триазолидами.

В данной работе предпринята попытка выяснить наличие зависимости между структурой синтезированных алкил(арил)судьфонил 1,2,4-триазолидов и возможностью развития адаптивного ответа к их мутагенному и токсическому действию у Drosophila melanogaster.

Материалы и методы

Объектом исследования служили имаго и личинки Drosophila melanogaster дикой линии Canton-S, которых содержали на стандартном корме [11, с. 18].

Для изучения были выбраны производные триазола алкил и арилсульфокислот. Исследовали производные 1,2,4-триазола (1,2,4-TrH): N-триазолид метансульфокислоты (CH₃SO₂TrН), N-триазолид бензолсульфокислоты (PhSO₂1,2,4-Tr) и N-триазолид толуолсульфокислоты (4-CH₃ ArSO₂1,2,4-Tr). Для того, чтобы понять способы проникновения соединений в половые клетки насекомых, с помощью программы HyperChem были рассчитаны физико-химические характеристики соединений и представлены в табл. 1.

 

Таблица 1 – Физико-химические характеристики алкил(арил)судьфонил 1,2,4-триазолидов

Исследованные соединения	1,2,4-TrH	CH₃SO₂TrН	PhSO₂1,2,4-TrH	4-CH₃ArSO₂1,2,4-TrH
Молекулярная масса, г/моль	69,07	147,15	209,22	223,25
Молекулярный объем, Ǻ	258,91	407,04	568,12	618,7
Липофильность (LogP)	−0,12	−0,53	−0,04	0,11
Энергия гидратации	−11,48	−8,07	−8,45	−7,2
Величина дипольного момента, Дб	2,7	3,03	4,76	5,33

 

Соединения использовали в виде водных эмульсий в двух дозах: нетоксичной (концентрация 0,001 мг/мл) и дозе LD₅₀, величины которых представлены в табл. 2.

 

Таблица 2 – Величина дозы LD₅₀ исследуемых соединений для имаго Drosophila melanogaster

Исследуемые соединения	Самки	Самцы
1,2,4-TrH	59,63 мг/мл	53,00 мг/мл
CH₃SO₂TrН	16 мг/мл	13 мг/мл
PhSO₂1,2,4-TrH	6,59 мг/мл	4,49 мг/мл
4-CH₃ArSO₂1,2,4-TrH	0,36 мг/мл	1,25 мг/мл

 

Методика анализа способности соединений индуцировать доминантные летальные мутации у Drosophila melanogaster [12]

Эксперимент проводился в двух сериях: в первой серии соединения испытывали в рассчитанной дозе LD₅₀ для имаго дрозофилы, во второй серии соединения использовали в концентрации 0,001 мг/мл, нетоксичной для имаго дрозофилы.

Для исследования способности веществ индуцировать доминантные летали у самцов, 3–4-дневных девственных самцов (900 особей) в течение 24 часов содержали в популяционном ящике (V = 500 мл), куда помещали чашку Петри, диаметром 3,5 см с нанесенным на желатин раствором исследованного вещества в заданной концентрации, и затем скрещивали с 600 интактными девственными самками, того же возраста.

Для анализа способности веществ индуцировать доминантные летали у самок трех-четырёхдневных девственных самок в количестве 900 штук, подвергнутых воздействию исследуемых веществ, как и самцов в предыдущей серии, скрещивали с 600 интактными самцами.

Через сутки после скрещивания в популяционные ящики ставили чашки Петри (диаметр 3,5 см) с кормом через каждые 2 часа в течение 10 часов, после чего производили подсчет отложенных яиц в каждой чашке. Чашки с яйцами содержали в термостате при +24°С в течение 30 часов, затем подсчитывали число невылупившихся яиц.

Подсчет доминантных летальных мутаций (ДЛМ) проводили по формуле:

ДЛМ = (А / В) × 100%,

где А – количество яиц с доминантными леталями; В – общее количество отложенных яиц.

Методика анализа развития адаптивного ответа у Drosophila melanogaster при кратковременном воздействии нетоксичными дозами триазолидов на имаго

Исследования проводили в двух сериях, для самок и самцов в отдельности. Для этого 900 самцов (самок) в течение 24 часов содержали в популяционных ящиках (объём – 500 мл), куда были внесены чашки Петри со стандартным кормом и нанесённым на него исследуемым соединением в концентрации 0,001 мг/мл. Затем особи Drosophila melanogaster подвергались суточному воздействию вещества в дозе LD₅₀, после чего их скрещивали с 500 интактными девственными самками (самцами) и подсчитывали число индуцированных доминантных леталей по описанной выше методике.

Методика создания преадаптации нетоксичной дозой триазолов к их генотоксичности в дозе LD₅₀ в течение онтогенеза Drosophila melanogaster

Для анализа использовались девственные самки и самцы в возрасте семи дней, которые раздельно содержались на стандартном корме. Далее самок и самцов совместно помещали в пробирки с кормом, в котором содержалось исследуемое вещество в дозе 0,001 мг/мл для откладки яиц в течение суток.

Через 24 часа имаго удаляли, а пробирки (с веществом в дозе 0,001 мг/мл) и отложенными яйцами помещали в термостат при +24°С для развития личинок. По мере вылета имаго проводился отбор девственных самок и самцов. Отобранных девственных самок и самцов раздельно на сутки помещали в стаканы объёмом 0,5 л по 900 особей, туда же ставилась чашка Петри диаметром 3,5 см с кормом, на который было нанесено исследуемое соединение в дозе LD₅₀. Через 24 часа чашка с кормом и нанесённым на него веществом изымалась, а в стаканы для спаривания добавляли интактных особей противоположного пола по 500 штук.

Определяли число индуцированных доминантных леталей по описанной выше методике.

Полученные данные сравнивали с результатами прямого действия соединений на имаго в дозе LD₅₀. Достоверность различий между генотоксичным действием веществ, их физико-химическими свойствами и чувствительностью имаго разных полов к генотоксикантам определяли с помощью двухфакторного дисперсионного анализа и критерия Стьюдента, определяемого по методу «выборочных долей» [13, с. 113–128, 159–195].

Результаты и обсуждения

Результаты анализа мутагенности соединений в нетоксичной дозе (0,001 мг/мл) представлены в табл. 3.

 

Таблица 3 – Способность триазолидов в нетоксичной дозе (0,001 мг/мл) индуцировать ДЛМ у имаго Drosophila melanogaster

Исследуемые соединения	Число индуцированных ДЛМ, %
	у самок	у самцов
1,2,4-TrH	11,50 ± 1,06	9,30 ± 0,96
CH₃SO₂TrН	19,90 ± 1,33	18,90 ± 1,31
PhSO₂1,2,4-TrH	7,10 ± 0,84	12,10 ± 1,09
4-CH₃ArSO₂1,2,4-TrH	5,13 ± 0,74	9,50 ± 0,99
Контроль	2,29 ± 0,49	5,23 ± 0,74

 

Все исследованные гетероциклические азолы достоверно индуцируют доминантные летали по сравнению с контролем (p < 0,01). Проведённый полный двухфакторный дисперсионный анализ показал, что в нетоксичной дозе все соединения достоверно не различаются по мутагенности для имаго обеих полов. Метод сравнения выборочных долей позволил выявить, что сульфурильные производные триазола, содержащие беззольные кольца: PhSO₂1,2,4-TrH и 4˗CH₃ArSO₂1,2,4-TrH, более слабые мутагены, чем 1,2,4-TrH и CH₃SO₂TrН (p < 0,04).

Проведенный однофакторный дисперсионный анализ показал, что определяющим в развитии мутагенного ответа у самок и самцов дрозофилы при воздействии нетоксичными дозами является величина липофильности. У самок, у которых образование яйцеклеток идет в течение всей жизни, на мутагенность соединений достоверно влияет и величина дипольного момента синтезированных триазолов.

Можно предположить, что триазолы, способные быстро проходить через мембраны клеток, способны привести к накоплению в популяциях организмов, устойчивых к их действию, так создадут вектор устойчивости.

Использование триазолов в дозе LD₅₀, традиционно используемой токсикологами, в сущности отражает реакцию всего генотипа сопротивляться к их мутагенному действию.

Анализ мутагенности исследуемых соединений в дозе LD₅₀ выявило различия в мутагенности исследуемых веществ (p < 0,01) см. табл. 4.

 

Таблица 4 – Способность исследуемых триазолов в дозе LD₅₀ индуцировать ДЛМ у имаго Drosophila melanogaster

Исследуемые соединения	Число индуцированных ДЛМ, %
	у самок	у самцов
1,2,4-TrH	23,90 ± 1,19	21,20 ± 1,05
CH₃SO₂TrН	41,20 ± 1,54	39,7 ± 1,53
PhSO₂1,2,4-TrH	13,92 ± 1,15	18,30 ± 1,29
4-CH₃ArSO₂1,2,4-TrH	10,24 ± 1,01	17,37 ± 1,26
Контроль	2,29 ± 0,49	5,23 ± 0,74

 

Проведённый двухфакторный дисперсионный анализ показал, что соединения достоверно различаются по способности индуцировать доминантные летали у имаго Drosophila melanogaster (p < 0,01). Однако различий в чувствительности имаго разных полов к мутагенному действию не выявлено. Мутагенность исследуемых соединений убывает в следующем ряду:

CH₃SO₂TrН > 1,2,4-TrH > PhSO₂1,2,4-TrH > > 4-CH₃ArSO₂1,2,4-TrH

Однофакторный дисперсионный анализ выявил, что среди проанализированных физико-химических свойств определяющими в развитии мутагенного ответа у имаго дрозофилы являются величины липофильности и дипольного момента исследуемых триазолов.

Максимальной липофильностью обладает 4-CH₃ArSO₂ 1,2,4-TrH, и, следовательно, данное соединение способно проникать внутрь клеток, растворяясь в билипидном слое наружных мембран. В то время как 1,2,4-TrH и CH₃SO₂TrН, имеющие меньшую липофильность и самую низкую молекулярную массу, способны связываться как с рецепторами, которые узнают лиганды, включающие в себя кольцо триазола, так и с имидазолиновыми рецепторами [14, p. 22–42]. Таким образом, можно предположить, что подобные соединения быстрее проникают внутрь клетки и влияют на её метаболизм. Мутагенный ответ зависит и от преобразования мембран, подвергшихся воздействию триазолов, на что указывает связь между числом доминантных леталей и величиной дипольного момента исследуемых веществ.

По-видимому, различия в мутагенности при прямом воздействии зависят как от скорости достижения веществами «клеток-мишеней» (в нашем случае ооциты и сперматозоиды дрозофилы), так и от метаболических процессов, после которых исследуемые соединения подвергаются трансформации.

Чтобы выяснить механизм развития адаптивного ответа, провели две серии экспериментов, результаты которых суммированы табл. 5.

 

Таблица 5 – Способность Drosophila melanogaster адаптироваться к генотоксичности триазолидов

Исследуемые соединения	Величина ДЛМ, %
	Кратковременная преадаптация 0,001 мг/мл (имаго) + LD₅₀ (имаго)		Долговременная преадаптация 0,001 мг/мл (личинки) + LD₅₀ (имаго)
	самки	самцы	самки	самцы
1,2,4-TrH	12,33 ± 1,17	12,68 ± 1,11	11,01 ± 1,12	7,69 ± 0,89
CH₃SO₂TrН	26,11 ± 1,49	26,60 ± 1,47	23,44 ± 1,47	23,60 ± 1,42
PhSO₂1,2,4-TrH	9,02 ± 1,05	15,49 ± 1,20	8,32 ± 0,97	14,73 ± 1,18
4-CH₃ArSO₂1,2,4-TrH	7,09 ± 0,98	13,75 ± 1,15	6,43 ± 0,83	7,41 ± 0,87

 

При кратковременной преадаптации исследуемыми ксенобиотиками в нетоксичной дозе и последующем воздействием этими же соединениями в дозе LD₅₀ количество индуцированных ДЛМ у самок было достоверно ниже, чем количество ДЛМ индуцированных при прямом действии производных триазола в дозе LD₅₀, то есть наблюдается адаптивный ответ у самок (p < 0,05). При преадаптации самцов такой ответ не наблюдается. Кроме того, при преадаптации наблюдаются достоверные различия в действии соединений, самый слабый адаптивный ответ наблюдается у соединений имеющих бензольное кольцо (p < 0,03). По-видимому, развитие адаптивного ответа к триазолидам возможно только в активно делящихся клетках, а так как у самцов имаго сперматогенез происходит только на личиночной стадии, то исследуемые вещества воздействовали на полностью дефинитивные сперматозоиды.

В серии экспериментов с длительным воздействием нетоксичными дозами триазолидов в личиночный период жизни были получены иные результаты. У самок долговременное воздействие на личиночный период жизни привело к тому, что последующее воздействие на имагинальную стадию соединениями в дозе LD₅₀ достоверно уменьшило число индуцированных доминантных леталей (p < 0,05), как и при кратковременном воздействии, а количество индуцированных доминантных леталей достоверно не отличается от количества ДЛМ, индуцированных нетоксичной дозой. Это позволяет нам предположить, что в любой делящейся ткани, в частности в будущей герментативной ткани, активируются репаративные системы. Это также подтверждается и тем, что у самцов после долговременной преадаптации развивается адаптивный ответ у имаго, так как число индуцированных ДЛМ после преадаптации этого типа достоверно меньше (p < 0,03), чем при прямом воздействии. Выявленные нами достоверные отличия в числе индуцированных ДЛМ у имаго дрозофилы после кратковременной и долговременной преадаптации (p < 0,04) позволяют говорить о том, что активируются репаративные системы различного типа. Наши эксперименты не позволяют точно сказать, какие именно механизмы репарации, но можно предположить, что при кратковременной преадаптации активируются механизмы пострепликативной репарации, с активацией ферментов типа гликозилаз и трансфераз, в то время как при долговременной преадаптации активируются ферменты дорепликативной репарации.

Раннее было показано, что триазолы способны вмешиваться в метаболизм пуринов [15, с. 12–21], последствием чего и является мутагенный ответ, наблюдаемый нами в эксперименте. Известно, что метаболизм пуринов в клетке включает в себя большое количество химических реакций, наиболее энергетически затрачиваемая из которых является реакция циклизации, в результате которой возникает имидазолное кольцо. Появление свободного триазола способно ускорить этот процесс, в результате чего появляется аналоги гуанина, или аденина, которые будут способны встраиваться в реплицирующуюся ДНК. В зависимости от активности ферментов типа пурин-трансфераз и специфических гликозилаз, химерные нуклеотиды будут эффективно или неэффективно устраняться, приводя к появлению мутаций, с заменой пар оснований. В зависимости от того, в каком из генов, отвечающих за процессы регуляции оогенеза или сперматогенеза, произошла мутация, наблюдается появление доминантных летальных мутаций.

Полученные нами результаты частично не совпадают с результатами по исследованиям мутагенности имидазолидов [16, с. 750], которые не обнаружили развития адаптивного ответа у имаго дрозофилы при кратковременной преадаптации. Известно, что деградация ксенобиотиков, осуществляемая тремя путями: окислительно-восстановительным, гидролитическим и трансферазным – происходит только на определенных стадиях онтогенеза насекомых и тесно взаимосвязана со структурными особенностями ксенобиотиков [2, с. 34]. Возможно, полученные различия связаны с физико-химическими отличиями триазолидов от имидазолидов. Известно, что 1,2,4-триазол обладает более выраженными ароматическими свойствами, чем имидазолиды. Взаимодействие сопряженной системы и отдельных атомов в этой молекуле выражены резче, чем в имидазоле, поэтому триазол имеет более выраженную основность и участвует в иных метаболических шунтах, чем имидазол.

Триазолиды более токсичны, чем имидазолиды. Как показали фармакологические исследования, все производные тразола – фунгициды – имеют общий механизм действия: нарушают синтез эргостерола, основного компонента мембран грибов и ингибируют цитохром P₄₅₀-зависимого фермента [17, с. 465]. Есть данные, что триазолы усиливают неспецифическую проницаемость мембран не только патогенных грибов, но и растений, что в конечном итоге изменяет метаболизм клеток [18, с. 52]. Однако триазолы метаболизируют медленнее, чем имидазолы и, по-видимому, поэтому более длительно воздействуют на репаративные системы, что используется для получения высокоэффективных пестицидов. Наблюдаемое нами явление снижения мутагенной активности при введении в структуру гетероциклического аналога триазола добавочного высоколипофильного бензольного ядра связано с торможением процессов клеточного деления, что позволяет активировать добавочные механизмы репарации.

Широкое использование в сельском хозяйстве фунгицидов, производных триазола, выявило ряд неожиданных эффектов как у защищаемых растительных культур, так и у насекомых, как вредителей полей, так в соседних экосистемах, многие из этих эффектов оказались негативными [17, с. 466]. Однако никогда ранее не исследовались возможности растений и насекомых приспосабливаться к генотоксическому действию соединений. Возникает вопрос о потенциальной экологической опасности подобного рода ксенобиотиков. Решение этой проблемы упирается в количественную оценку негативного воздействия. Предложенная нами моделирование возможных адаптаций в искусственных условиях, с последующим учётом доминантных летальных мутаций, позволяет отчасти решить эту проблему, что совпадает с мнением некоторых авторов [19, с. 137]. Негативное воздействие ксенобиотиков на природные экосистемы связано и с тем, что они какое-то время находятся на поверхности растения, подвергаясь воздействию климатических изменений и, следовательно, усиливая или ослабляя своё действие в зависимости от строения, что также влияет на скорость проникновения их в растительные и животные организмы, создавая условия для возникновения адаптаций к ним в следующих поколениях [20, с. 64].

Заключение

Исследуемые триазолы способны индуцировать доминантные летальные мутации у имаго дрозофилы как в нетоксичной дозе, так и в дозе LD₅₀ и представляют собой известную экологическую опасность для экосистем, соседствующих с агроценозами. На число доминантных мутаций влияет как строение соединений (сульфурильные производные триазола производные триазола, содержащие бензольные кольца, менее мутагены, чем сам триазол и триазолил метансульфокислоты), так и их липофильность.

Анализируемые триазолы в нетоксичных дозах способны вызывать развитие адаптивного ответа, выражающегося в достоверном уменьшении числа индуцированных ими доминантных леталей у Drosophila melanogaster. На способность развивать адаптивный ответ достоверно влияют величины липофильности и дипольного момента. Адаптивный ответ к генотоксическому действию триазола и его сульфурильных производных возможен только в тканях с высокой пролиферативной активностью.

В связи с этими исследованиями можно предположить, что любое попадание в экосистемы даже небольших количеств гетероциклических азолов создаёт возможности для активации у насекомых механизмов адаптации к ксенобиотикам подобного рода, выступая в качестве фактора селекции, приводящей к появлению популяций насекомых, устойчивых к пестицидам.

About the authors

Ekaterina Sergeevna Selezneva

Samara National Research University

Author for correspondence.
Email: catana7@yandex.ru

candidate of biological sciences, associate professor of Biochemistry, Biotechnology and Bioengineering Department

Russian Federation, Samara

Zoya Petrovna Belousova

Samara National Research University

Email: zbelousova@mail.ru

doctor of chemical sciences, professor of Inorganic Chemistry Department

Russian Federation, Samara

Vadim Aleksandrovich Isaichkin

Samara National Research University

Email: vadim.isaichkin.99@mail.ru

master student of Biochemistry, Biotechnology and Bioengineering Department

Russian Federation, Samara

References

Supplementary files