Microcrystallization method use for assessing the content of secondary metabolites of lichens

Full Text

Химический состав лишайников очень специфичен, так как для лишайников в целом и для каждого из их компонентов (микобионта и фотобионта) в отдельности характерен особый тип метаболизма [1, p. 33]. Органические вещества, встречающиеся в лишайниках, по своей природе подразделяются на две основные группы: первичные и вторичные вещества (метаболиты). Первичные вещества – это белки, аминокислоты, полисахариды, витамины и прочие органические соединения, которые, будучи синтезированы фотобионтом или микобионтом, находятся внутри их клеток – часто они растворимы в воде. Подобные соединения встречаются также, например, у свободноживущих грибов, водорослей и высших растений [2, с. 173]. Среди полисахаридов преобладает лихенин – полимер, мономером которого является D˗глюкоза [3, с. 603]. Вторичные лишайниковые вещества синтезируются микобионтом, хотя углерод, необходимый для их синтеза, грибной компонент лишайника получает от синтезирующего органические соединения фотобионта. Вторичные вещества находятся в талломе лишайника экстрацеллюлярно, накапливаясь на поверхности грибных гиф. Обычно они нерастворимы в воде [2, с. 173]. К настоящему времени выявлено более 600 вторичных метаболитов лишайников [4, p. 42].

Концентрация вторичных лишайниковых веществ не всегда остаётся постоянной, так как она зависит от воздействия абиотических факторов, таких как влажность, свет, температура, время года и т.п. [5, с. 76]. Так, например, было отмечено, что концентрация усниновой кислоты в талломах Cladonia arbuscula, Cladonia stellaris и Flavocetraria cucullata зависит от времени года [6, с. 48]: наибольшее её количество накапливается в июне, а наименьшее – в декабре. Встречаются и наблюдения, когда наибольшая концентрация выявляется в период весна – осень, но наименьшее содержание остаётся неизменным и отмечается зимой [7, с. 89]. Конечно, здесь следует учитывать, что в талломах лишайников содержание воды колеблется в самых широких пределах, в связи с чем довольно сложно проводить исследования по изучению химического состава данных организмов. Тем не менее есть указания в литературе, что наибольшее содержание вторичных лишайниковых метаболитов наблюдается в местах с частым выпадением осадков, например, в условиях лесного пояса [8, с. 79]. Предполагается, что при повышенной влажности фотобионт начинает активно работать, и в связи с этим интенсивно синтезируются в лишайнике вторичные метаболиты. Опираясь на вышеприведённые данные, можно сказать, что вторичные метаболиты более интенсивно образуются при температуре от +1°C до +12°C и в хорошо освещённых местах, например, в светлохвойной тайге [5, с. 73] или лесах с достаточно высокой разреженностью древостоя. Было выявлено также, что вторичные лишайниковые вещества не накапливаются с возрастом лишайника, что они являются соединениями, которые активно используются в их обмене веществ [8, с. 81].

Для качественного и количественного определения вторичных метаболитов лишайников чаще всего используют тонкослойную хроматографию, включая высокоэффективную тонкослойную хроматографию и высокоэффективную жидкостную хроматографию [9, p. 281], хотя исторически самыми первыми применялись методы нанесения химических реагентов непосредственно на слоевище лишайника (точечные тесты) для получения характерных изменений цвета и микрохимические методы [10, p. 117]. Несмотря на то, что микрохимические методы менее чувствительны, чем методы хроматографии, которые стали уже классическими в лихенологии, особенно после работ Ч.Ф. и У.Л. Калберсонов (по: [9, p. 281]), они довольно просты, дёшевы, более быстрые и не требуют специального оборудования. Однако имеющиеся в литературе образцы формы кристаллов (например, [11, p. 43–44; 12, p. 124–125]) получены из экстрактов с использованием в качестве растворителя глицерин-ледяную уксусную кислоту, глицерин-этанол-воду, глицерин-этанол-орто-толуидин и другие, причём нигде не указывается ацетон, хотя он широко используется для первичной экстракции вторичных лишайниковых метаболитов при тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии [9, p. 284, 285].

Целью данной работы является описание кристаллов некоторых вторичных метаболитов лишайников из ацетоновых вытяжек для последующего их использования при оценке влияния экологических факторов на их накопление в талломах.

В качестве объектов исследования были использованы следующие виды лишайников: Bryocaulon divergens, Cladonia phyllophora, Cladonia stellaris, Dactylina ramulosa, Flavocetraria nivalis, Solorina crocea, Stereocaulon alpinum, Thamnolia vermicularis из Чукотского автономного округа и Evernia prunastri, Parmelia sulcata из Самарской области.

Методы исследования

В первом эксперименте получали чистые вторичные метаболиты лишайников методом тонкослойной хроматографии. Для этого измельчали образцы и добавляли 1 мл ацетона. Через неделю наносили ацетоновый экстракт лишайника на пластины для тонкослойной хроматографии, помещали на 10 минут в пары ледяной уксусной кислоты, а потом в хроматографическую камеру с сольвентом С (толуол и уксусная кислота в соотношении 17:3) [11, p. 51]. Для идентификации веществ использовали облучатель хроматографический с l = 254 нм и l = 380 нм, а также обработку 10% раствором серной кислоты с последующим прогреванием при температуре +110°C. Зная Rf-фактор и цвет вещества после обработки серной кислотой, а также интенсивность и характер его свечения в ультрафиолетовых лучах, можно определить вид химического соединения [11]. Чтобы получить чистое вещество, все эксперименты осуществляли в двукратной повторности, при этом половину пластин использовали для идентификации веществ, а другую оставляли без обработки серной кислотой, на ней только определяли вещества под ультрафиолетом. После всего этого скальпелем снимали силикагель с чистым веществом в пробирку Эппендорфа и экстрагировали 4–5 каплями чистого ацетона.

Во втором эксперименте получали кристаллы чистых вторичных метаболитов лишайников из ацетоновых экстрактов. Капилляром брали каплю экстракта из пробирки Эппендорфа и перемещали на чистое предметное стекло. После высыхания ацетона предметное стекло просматривали в микроскоп Микромед-6 на наличие кристаллов при увеличении ×280 и фотографировали с помощью программы ToupView 3.7.27.74.

Результаты и их обсуждение

Нам удалось идентифицировать и выделить в чистом виде 10 вторичных лишайниковых метаболита: фумарпротоцетраровую, эверновую, усниновую, солориновую, оливеторовую, перлатоловую, физодаловую, салациловую, тамноловую кислоты и атранорин, с которыми и проводили все дальнейшие исследования.

Оказалось, что разные вторичные метаболиты кристаллизуются в разных частях капли экстракта при высыхании растворителя (ацетона) на предметном стекле. Так, у самого края капли следует искать кристаллы эверновой кислоты и атранорин; на периферии капли, но не у самого края – салациновой кислоты; в центре капли обычно образуются кристаллы фумарпротоцетраровой, усниновой, физодаловой, солориновой, тамноловой, оливеторовой и перлатоловой кислот.

Форма кристаллов специфична для каждого вещества и представлена на рисунке 1, а их количество, размеры и степень агрегации зависят от концентрации в растворе, что в свою очередь определяется экологическими условиями произрастания, возраста особей и других факторов. Характеристика выявленных десяти веществ приведена в таблице 1.

Таблица 1 – Характеристика некоторых вторичных метаболитов лишайников

Название	Структурная и молекулярная формулы	Характеристика кристаллов из ацетоновых экстрактов	Температура плавления	Название	Структурная и молекулярная формулы	Характеристика кристаллов из ацетоновых экстрактов	Температура плавления
Атранорин	C₁₉H₁₈O₈ [13]	Кристаллы звёздчатой формы 17–51 мкм в диаметре	+195°C [13]	Усниновая кислота	C₁₈H₁₆O₇ [19]	Кристаллы призматические 27–268 × 12–115 мкм	+204°C [20]
Оливеторовая кислота	C₂₆H₃₂O₈ [14]	Кристаллы перистой формы 52–135 × 35–70 мкм	–	Физодаловая кислота	C₂₀H₁₆O₁₀ [21]	Кристаллы игольчатой формы 70–123 × 7–11 мкм	+245°C [16, c. 54]
Салациновая кислота	C₁₈H₁₂O₁₀ [15]	Кристаллы звёздчатой формы 11–21 мкм в диаметре	+260…+280°C [16, c. 55]	Фумарпротоцетраровая кислота	C₂₂H₁₆O₁₂ [22]	Палочковидные разветвлённые кристаллы 35–237 × 5–10 мкм	+250…+260°C [16, c. 55]
Солориновая кислота	C₂₁H₂₀O₇ [17]	Палочковидные разветвлённые кристаллы 56–168 × 10–20 мкм	–	Эверновая кислота	C₁₇H₁₆O₇ [23]	Кристаллы звёздчатой формы 12–23 мкм в диаметре	+172…+174°C [16, c. 54]
Тамноловая кислота	C₁₉H₁₆O₁₁ [18]	Кристаллы широкоовальной формы 11–33 × 6–27 мкм	–	Перлатоловая кислота	C₂₅H₃₂O₇ [24]	Кристаллы овальной формы 25–26 × 15–16 мкм	+108…+110°C [25, с. 1027]

Выявлено, что звёздчатые кристаллы имеют атранорин, салациновая и эверновая кислоты, причём наиболее крупные у атранорина, а самые мелкие – у салациновой кислоты. Палочковидные разветвлённые кристаллы образуют солориновая и фумарпротоцетраровая кислоты, более широкие у первой, но более длинные у второй. Овальная форма кристаллов у более крупной тамноловой и мелкой, и узкой перлатоловой кислоты. Усниновая, физодаловая и оливеторовая кислоты образуют уникальные формы кристаллов – призматическую, игольчатую разветвлённую и перистую соответственно.

Рисунок 1 – Кристаллы вторичных метаболитов лишайников, полученные из ацетоновых экстрактов: А, Б – фумарпротоцетраровая кислота из Cladonia phyllophora; В, Г – эверновая кислота из Evernia prunastri; Д, Е – усниновая кислота из Flavocetraria nivalis; Ж, З – солориновая кислота из Solorina crocea; И – оливеторовая кислота из Bryocaulon divergens; К – перлатоловая кислота из Cladonia stellaris; Л – физодаловая кислота из Dactylina ramulosa; М – салациловая кислота из Parmelia sulcata; Н – атранорин из Stereocaulon alpinum; О – тамноловая кислота из Thamnolia vermicularis

Наблюдать кристаллы вторичных метаболитов лишайников удаётся при обычном световом микроскопе под объективом ×40 без иммерсионного масла. Для последующей сравнительной оценки количества веществ необходимо, во-первых, стандартизировать навеску изучаемого таллома лишайника; во-вторых, использовать строго фиксированный объём ацетона как универсального растворителя химических соединений, образующихся в лишайниках; в-третьих, просматривать не менее четырёх сторон высохшей капли на предметном стекле и в баллах выявлять их суммарное количество; в-четвёртых, отмечать наличие, степень разветвления и агрегации кристаллов в конгломераты.

Выводы

Таким образом, зная внешний вид вторичного метаболита лишайника, можно довольно быстро идентифицировать, накапливает ли в конкретных экологических условиях таллом данное вещество или нет, а по степени агрегации кристаллов и их количеству можно оценить концентрацию данного метаболита, что позволит выявить факторы, влияющие на метаболизм лишайников.

Благодарности

Авторы благодарят к.б.н., старшего научного сотрудника ФИЦ биотехнологии РАН Самылину Ольгу Сергеевну за сбор образцов лишайников с территории Чукотского автономного округа.

About the authors

Anastasia Pavlovna Kasyanova

Email: anastasiakasyanova22@mail.ru

student of Biological Faculty

Evgeniy Sergeevich Korchikov

Author for correspondence.
Email: evkor@inbox.ru

candidate of biological sciences, associate professor of Ecology, Botany and Nature Protection Department

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. Table 1

Download (25KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2. Table 1

Download (29KB)

Indexing metadata

4. Fig. 3. Table 1

Download (31KB)

Indexing metadata

5. Fig. 4. Table 1

Download (33KB)

Indexing metadata

6. Fig.51. Table 1

Download (36KB)

Indexing metadata

7. Fig. 6. Table 1

Download (34KB)

Indexing metadata

8. Fig. 7. Table 1

Download (22KB)

Indexing metadata

9. Fig.81. Table 1

Download (24KB)

Indexing metadata

10. Fig. 9. Table 1

Download (32KB)

Indexing metadata

11. Fig. 10. Table 1

Download (27KB)

Indexing metadata

12. Fig. 1

Download (1MB)

Indexing metadata