Оценка экологической опасности изомеров фенольных производных 1,2,4-триазола для природных экосистем

Полный текст

Введение

Производные триазола широко используются в сельском хозяйстве как фунгициды и регуляторы роста [1, с. 37–44; 2, с. 12–21; 3, p. 55–138]. Несмотря на то, что триазолиды в почве сохраняются долго и относятся ко 2 классу опасности, их с точки зрения экологии традиционно считают мало опасными, так как для них характерны очень низкие нормы расхода 250 г действующего вещества на гектар [4].

Существует большое количество исследований, доказывающих способность производных триазолов позитивно воздействовать на урожайность плодовых, зерновых, овощных, бобовых, крупяных и декоративных культур [1, с. 37–44; 2, с. 12–21; 3, p. 55; 5, p. 63–70; 6, p. 149–154].

Механизм действия триазольных регуляторов роста изучен. Показана их способность вмешиваться в гормональный баланс растений [7, с. 626–630; 8, p. 267–278]. Однако цитогенетическая активность многих используемых в настоящее время ретардантов не исследовалась. Практически не изучались и отдаленные последствия длительного использования многих производных триазола.

Особый интерес представляют исследования, в которых триазолиды используются в сверхмалых дозах, в которых они попадают в экосистемы. Между тем известно, что постоянное применение в неконтролируемых дозах биологически активных веществ создает условия для отбора редких генотипов сорных растений, устойчивых к их действию. Именно поэтому продолжаются поиски новых высокоэффективных соединений, механизм действия которых отличался бы от такого у ранее синтезированных препаратов. Затраты на синтез таких соединений и испытаний очень высоки. Поэтому необходимы модельные эксперименты с использованием ряда структурных аналогов химических соединений. Они позволят в дальнейшем осуществить направленный синтез новых биологически активных соединений.

Цель исследования: определение влияния фенольных производных, содержащих фрагмент 1,2,4-триазола, различающихся положением гидроксильной группы в бензольном кольце, на ростовые процессы семян Allium fistulosum L. и проведение сравнительного анализа их биологической активности с точки зрения экологической опасности.

Материалы и методы исследований

Токсичность и цитогенетическую активность спиртовых растворов 2-(1Н-1,2,4-триазолил-метил)фенола (орто-изомера) и 4-(1Н-1,2,4-триазолил-метил)фенола (пара-изомера).

Растворителем служил 0,1% изопропиловый спирт. Соединения использовали в трех концентрациях: 0,0001; 0,001; 0,01 мг/мл. В качестве тест-объекта использовали Allium fistulosum L. сорта «Апрельский». Было проведено 4 серии экспериментов, по три повтора для каждой серии.

1 серия. Контроль. Семена проращивали в 0,1%-м растворе изопропилового спирта.

2 серия. Семена проращивали в растворах исследуемых триазолидов в концентрации 0,0001 мг/мл.

3 серия. Семена проращивали в растворах исследуемых триазолидов в концентрации 0,001 мг/мл.

4 серия. Семена проращивали в растворах исследуемых триазолидов в концентрации 0,01 мг/мл.

По стандартной методике готовили давленные и окрашенные ацетокармином препараты меристемы корней лука [9, с. 86–97].

Токсичность веществ оценивали по способности ингибировать всхожесть семян и рост корней Allium fistulosum. Цитотоксичность и генотоксичность оценивали с помощью ана-телофазного анализа [10, с. 23, 26; 11, с. 93–98].

Достоверность и различий между воздействием исследуемых веществ в разных концентрациях; опытом и контролем оценивали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа и непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни [12, с. 159–179].

Результаты исследований и их обсуждение

Изучалось влияние 2- и 4-(1Н-1,2,4-триазолил-метил)фенолов на всхожесть семян. Результаты представлены на рис. 1.

 

Рисунок 1 – Влияние 2- и 4-(1Н-1,2,4-триазолил-метил-фенолов на всхожесть семян A. fistulosum

 

Растворы указанных соединений проявили слабый токсический эффект во всех исследованных концентрациях. Проведенный двухфакторный дисперсионный анализ выявил достоверные различия между воздействиями соединений для p < 0,003, по сравнению с контролем. Однако достоверных различий как между гомологами, так и исследованными концентрациями обнаружено не было.

Полученные нами результаты частично согласуются с работами других авторов, работающих на высокоэффективном фунгициде тебуконазоле, производном триазола. Они обнаружили способность этого фунгицида ингибировать всхожесть семян Allium cepa в концентрации 12,5 мкг/мл. С увеличением концентрации возрастала его токсичность, а в концентрации 200 мкг/мл, то есть 0,2 мг/мл, семена не прорастали [13, p. 207].

Мы использовали концентрации на два порядка ниже, чтобы изучить, как влияют следовые количества синтезированных нами соединений на природные экосистемы. Обнаружили, что в диапазоне концентраций от 0,0001 мг/мл до 0,01 мг/мл, то есть 10 мкг/мл, токсичность синтезированных нами производных не меняется.

Однако даже в этих столь незначительных концентрациях обнаружили, что оба вещества ингибируют рост корней (рис. 2).

 

Рисунок 2 – Влияние 2- и 4-(1Н-1,2,4-триазолил-метил)фенолов на среднюю длину корней A. fistulosum на пятый день роста

 

Оба изомера ингибировали рост корней во всех исследованных концентрациях. Но их токсичность проявлялась по-разному. Токсичность триазолида, содержащего ОН-группу в пара-положении, не менялась в избранном диапазоне концентраций. Для его изомера, содержащего группу в орто-положении, токсичность возрастала с увеличением его концентрации, достигая в максимальной дозе (0,01 мг/мл) токсичности его пара-изомера (p < 0,05). Различия в токсичности изомеров подтверждается и проведенным анализом с использованием непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Ингибирование роста под действием 2- и 4-(1Н-1,2,4-триазолил-метил)фенолов, наблюдаемое нами, сходно и с результатами других исследователей, работающих с известными триазольными пестицидами. Так, ингибирование роста корней Allium cepa под действием тебуконазола начиналось с концентрации 12,5 мкг/мл (0,0125 мг/мл), снижалась скорость роста корней и у водного макрофита Bidens laevis, подвергшегося воздействию в концентрации 10 мкг/л (0,01 мг/мл) [14, p. 353–357].

Ретардантное действие триазолов и их производных обусловлено подавлением биосинтеза гиббереллина в трех его звеньях уже на ранних стадиях развития растений [15, p. 2491–2500; 16, p. 1197–1210]. Кроме того, некоторые производные триазолов способны подавлять действие экзогенного гиббереллина [17, p. 5–11; 18, p. 63–72].

Однако определяющее значение в ростовых процессах принадлежит митотической активности корневой меристемы. Известно, что некоторые фенольные соединения могут стимулировать клеточную пролиферацию [19; 20, с. 62–66].

Следующим этапом наших исследований была оценка величины митотического индекса в клетках корневой меристемы тест-объекта. Результаты исследований по влиянию исследованных соединений на величину митотического индекса представлены на рис. 3.

 

Рисунок 3 – Влияние 2- и 4-(1Н-1,2,4-триазолил-метил)фенолов на величину митотического индекса клеток корневой меристемы A. fistulosum

 

Анализ полученных результатов показал, что оба изомера достоверно (p < 0,05) ингибируют пролиферацию клеток меристемы по сравнению с контролем, но различий в действии изомеров с OH-группой в пара- и орто-положении на величину митотического индекса не наблюдается. Однако мы обнаружили парадоксальную реакцию: в минимальной концентрации 0,0001 мг/мл оба изомера демонстрируют максимальную цитотоксичность, и с увеличением их концентрации цитотоксичность падает по сравнению с контролем.

Необходимо отметить, что другие триазолиды также ингибируют клеточную пролиферацию. Снижение митотического индекса и увеличение числа хромосомных аберраций наблюдали и при действии тебуконазола (0,01 мг/мл) на Bidens laevis [14, p. 353–357]. Но, в отличие от полученных нами данных, в их экспериментах цитотоксичность росла с увеличением концентрации.

Впервые «парадоксальные» эффекты химических веществ (снижение токсического действия ксенобиотика при повышении дозы или увеличение эффекта на низких уровнях доз, би- или полимодальная зависимость «доза‑эффект») были выявлены еще в начале XX столетия [21]. Впоследствии было показано, что «парадоксальные» эффекты в большинстве случаев выявляются на низких и сверхнизких дозах [22], что наблюдается и в нашем случае.

Подобную реакцию можно объяснить с позиции «лиганд-рецепторного» взаимодействия. В низких концентрациях лиганд связывается с наиболее активным центром рецептора. При увеличении концентрации лиганд связывается и с другими менее активными центрами, при этом снижая его сродство к субстрату, и тогда лиганд, связанный с первым центром, освобождает его. Взаимодействие с ним может произойти только тогда, когда концентрация вещества приблизится к значению константы диссоциации комплекса лиганда с этим центром рецептора [22; 23]. Возможно, что и триазолиды подобным же образом связываются с рецепторами, тогда эффективность их воздействия зависит от концентрации, и в сверхнизких дозах триазолилы действуют более эффективно, чем в высоких.

Если эти предположения верны, то мы должны обнаружить различное влияние 2- и 4-(1Н-1,2,4-триазолил-метил)фенолов и в концентрации, и в их действии на разные стадии митоза. Ранее нами было показано, что существует зависимость между структурой соединения и их физико-химическими параметрами, проявляющаяся в их митозомодифицирующем действии [24]. Результаты анализа способности 2- и 4-(1Н-1,2,4-триазолил-метил)фенолов влиять на фазы митоза в клетках корневой меристемы представлены на рис. 4.

 

Рисунок 4 – Влияние 2- и 4-(1Н-1,2,4-триазолил-метил)фенолов на относительную продолжительность фаз митоза клеток корневой меристемы A. fistulosum

 

4-(1Н-1,2,4-Триазолил-метил)фенол (пара-изомер) вызывает блок на стадии метафазы и анафазы в самой низкой концентрации (0,0001 мг/мл). С увеличением концентрации специфичность его действия исчезает, что выражается в общем профазном и метафазном блоке. Его орто-изомер демонстрирует высокую цитотоксичность, ингибируя клеточное деление на всех концентрациях на стадии профазы.

Известно, что остановка клеточного деления на стадии профазы является показателем способности веществ вмешиваться в синтез ДНК [25]. Остановка клеточного деления на стадии метафазы говорит о повреждении аппарата, обеспечивающего расхождение хромосом к полюсам: нитей веретена деления, кинетохоров и др. Блоки на стадии анафазы и телофазы говорят о нарушении цитотомии [26, с. 198–207].

Вещества, вмешивающиеся в синтез ДНК и ее предшественников, как правило, проявляют мутагенную активность. Мы обнаружили, что число хромосомных аберраций, индуцированных 2- и 4-(1Н-1,2,4-триазолил-метил)фенолами, зависит как от их строения, так и от концентрации (p < 0,05) (рис. 5).

 

Рисунок 5 – Мутагенность исследуемых 2- и 4-(1Н-1,2,4-триазолил-метил)фенолов для A. fistulosum

 

Пара-изомер менее мутагенен, чем орто-изомер. У орто-изомера мутагенность слабо падает с увеличением концентрации.

2- и 4-(1Н-1,2,4-Триазолил-метил)фенолы, попадая в организм растения, включаются в сложные метаболические процессы, в результате которых могут образовываться триазол и фенолы. Триазол, входящий в структуру известных ретардантов, способен вмешиваться в онтогенез растений, ингибируя синтез гибберелина в процессе превращения энткаурена в кауреновую кислоту [7, с. 626–630]. Второй активной группой является фенол. Природные фенолы известны как регуляторы роста [27]. Ранее было показано, что перемещение ОН-группы в орто- или мета-положение в феноле приводит к резкому снижению его активности [28, с. 303–322].

Парадоксальную цитологическую реакцию клеток корневой меристемы, когда с увеличением концентрации соединений снижается цитотоксичность, можно объяснить следующим образом. Возможно, 2- и 4-(1Н-1,2,4-триазолил-метил)фенолы способны связываться с белками, обеспечивающих клеточное деление, например с протеинкиназами циклинов [29, с. 121].

Различия в реакции клеточного метаболизма в ответ на воздействие пара и орто-гомологов связано с разной скоростью образования модифицированных белков-регуляторов. Пара-гомолог более цитотоксичен, а орто-гомолог более генотоксичен.

Возможно, в зависимости от концентрации исследованных веществ растения воспринимают их по-разному: в концентрации 0,00001 мг/мл как агонист известных фитогормонов, в концентрации 0,01 мг/мл – как ксенобиотик, нарушающий гомеостаз организма.

Оценивая возможный негативный эффект воздействия подобных соединений на экосистемы, можно утверждать, что применение орто-изомеров более опасно как для искусственных экосистем агропромышленных комплексов, так и для природных экосистем, контактирующих с ними.

Учитывая высокие затраты на поиск высокоэффективных пестицидов (в 2017 г. его объем затрат составил 68,5 млрд долларов США [30, с. 5–8]), усилия многих исследователей направлены на поиск закономерностей между структурой и функцией соединений. Поиски закономерностей осложняются как биологическим разнообразием живых организмов, так и различными подходами к решению этой проблемы – с позиции биохимии, медицинской химии, физической, органической химии и фармакологии [31, с. 119; 32, с. 3–19]. Именно поэтому все исследования, позволяющие понять механизмы возможного негативного воздействия химических соединений на экосистемы, необходимо продолжать.

Заключение

Механизмы ингибирования и мутагенности зависят от строения 2-(1Н-1,2,4-триазолил-метил)фенола и 4-(1Н-1,2,4-триазолил-метил)фенола, следовательно, и степень опасности для экосистем, в которые попадают подобного рода соединения, также зависит от их строения.

Синтезированные нами соединения проявляют выраженную ретардантную активность в исследованных крайне низких дозах, ингибируя всхожесть семян и рост корней, а также митотическую активность в клетках корневой меристемы тест-объекта. Изомер, содержащий ОН-группу в пара-положении, вызывает блок на стадии метафазы и анафазы в самой низкой концентрации, с ростом концентрации специфичность действия его исчезает, что выражается в общем профазном и метафазном блоках. Его орто-изомер ингибирует клеточное деление на всех концентрациях на стадии профазы в клетках корневой меристемы. Таким образом, исследуемые вещества останавливают клеточное деление на разных стадиях митоза в зависимости от строения и концентрации.

Оба соединения проявляют генотоксичность. Число хромосомных аберраций зависит от строения соединений и от концентрации. Пара-изомер менее мутагенен, чем его орто-изомер. У орто-изомера мутагенность слабо падает с увеличением концентрации. Самая высокая мутагенность характерна для соединения в самой низкой концентрации.

Орто-изомеры более опасны для экосистем, чем пара-изомеры.

Об авторах

Екатерина Сергеевна Селезнева

Самарский национальный исследовательский университет имени академика С.П. Королёва

Автор, ответственный за переписку.
Email: catana7@yandex.ru

кандидат биологических наук, доцент, доцент кафедры биохимии, биотехнологии и биоинженерии

Россия, Самара

Зоя Петровна Белоусова

Самарский национальный исследовательский университет имени академика С.П. Королёва

Email: zbelousova@mail.ru

доктор химических наук, доцент, профессор кафедры неорганической химии

Россия, Самара

Роберт Олегович Артюков

Самарский национальный исследовательский университет имени академика С.П. Королёва

Email: artyukov_robert@outlook.com

магистрант кафедры биохимии, биотехнологии и биоинженерии

Россия, Самара

Список литературы

Дополнительные файлы