Resistance of Aspergillus niger Tiegh. to the effect of amide anesthetics

Full Text

Введение

Патогенные микромицеты непрерывно испытывают мощное давление антропогенных факторов в виде воздействия на их популяции как специально синтезированных фунгицидов, так и препаратов, используемых в фармакологии, под влиянием которых многие их популяции погибают. Но иногда наблюдается явление, при котором препараты, используемые человеком в очень малых терапевтических дозах, воздействуя на патогенные микромицеты, стимулируют их рост или вызывают мутагенез, приводящий к появлению штаммов, устойчивых к известным фунгицидам.

Известно, что в естественных условиях к аспергиллёзу наиболее восприимчивы индейки, куры, цесарки, водоплавающая птица, лошади, крупный рогатый скот, овцы, собаки, свиньи, кролики, морские свинки. Болеют и беспозвоночные, например, медоносные пчёлы [1, с. 13–14; 2; 3, с. 119–120; 4, с. 29–36]. Грибы рода Aspergillus поражают семена и плоды многих культурных растений: хлопчатник, кукурузу, арахис, ячмень и др. [5, с. 58–61; 6].

Представители рода Aspergillus широко и повсеместно распространены в почвах, но преимущественно в регионах с тёплым климатом, обладают высокой метаболической активностью и адаптационной способностью, обильно спороносят в различных условиях, устойчивы к воздействию неблагоприятных факторов, являются продуцентами различных органических кислот, амилолитических, целлюлозолитических и других ферментов и разнообразных биологически активных веществ [7, с. 126].

Микромицеты являются причиной распространённых инфекций по всему миру. По данным статистики Всемирной организации здравоохранения, микозное заболевание аспергиллёз встречается у 12,5% населения планеты [8, с. 5]. Аспергиллёз характеризуется преимущественным поражением лёгких, токсико-аллергическими реакциями и обычно сопровождается тяжёлым течением болезни [8, с. 6; 9, с. 43–46; 10, с. 124–126].

Большую опасность представляют вторичные метаболиты плесневых грибов – афлатоксины, которые являются загрязнителями сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов, а также оказывают мутагенный эффект на животных и человека [11, p. 187–224].

Высокая токсичность грибов рода Aspergillus как для растений, так и для животных, устойчивость к различным фунгицидам и широкое распространение в природе делает необходимым проведение модельных исследований, в которых можно оценить их адаптивный ответ на различные ксенобиотики.

В связи с этим особый интерес вызывают широко используемые фармакологические препараты как в терапевтических дозах, так и в дозах во много раз меньших, чтобы оценить реакцию патогенных и условно-патогенных грибов на действие данных препаратов, то есть оценка их фунгицидной активности.

Исследования последних лет обнаружили у многих анестетиков антибактериальную и противовирусную активность [12, p. 687–694; 13, с. 6–13]. Механизм антибактериального действия местных анестетиков изучен недостаточно. Однако есть предположение, что анестетики, в частности лидокаин, разрушают клеточную мембрану бактерий, что приводит к утечке внутриклеточных компонентов и усилению дегидрогеназной активности [14, с. 73–83; 15, p. 1275–1279]. Фунгицидная активность данных препаратов пока не выявлена.

Целью данного исследования явилась оценка способности Aspergillus niger Tiegh. приспосабливаться к воздействию некоторых анестетиков амидного ряда при их использовании в терапевтических дозах.

Материалы и методы исследований

Тест-объектом в проведённых иccледованиях служил Aspergillus niger Tiegh., обладающий токсичностью и выраженной устойчивостью к действию различных биологически активных веществ [16, с. 97–110].

Из спор A. niger Tiegh. готовили суспензии с помощью магнитной мешалки концентрацией около 30 КОЕ/мл, которые засевали на плотные питательные среды. Инкубацию проводили в термостате при +26°C в течение трёх дней.

Для посева использовали классическую плотную среду Чапека [17]. На застывшую плотную питательную среду (чтобы избежать разрушения анестетиков при автоклавировании) добавляли стерильно растворы веществ в исследуемых концентрациях (3 повтора) в объёме 3 мл и 1 мл суспензии спор. Контрольными служили колонии гриба, выращенные на питательной среде с добавлением натрия хлорида, вспомогательного вещества в растворе анестетиков для инъекций.

В качестве показателей жизненности микромицета нами были избраны те из них, которые характерны для полностью сформированного состояния тест-объекта, чтобы исключить разницу в возрастных изменениях: толщина конидиеносца в верхней части и диаметр спор. Для этого готовили временный препарат по стандартной методике [18; 19]. С помощью бактериологической петли брали фрагмент мицелия и осторожно помещали его в каплю воды на предметное стекло. При малом увеличении находили конидиеносцы, хорошо видимые на краях препарата. Их детальное строение изучали при увеличении ×400. Диаметр спор и толщину конидиеносцев измеряли окуляр-микрометром в 9 повторностях.

Действие анестетиков на рост A. niger Tiegh. оценивали по числу колоний и степени разрастания мицелия (средний диаметр колоний, мм) в опыте и контроле.

Было проведены 2 серии экспериментов.

1 серия. Исследование антифунгальной активности разных концентраций амидных анестетиков.

Суспензию спор A. niger Tiegh. известной концентрации инкубировали в течение трёх дней в водных растворах для инъекций лидокаина, ропивакаина и бупивакаина в концентрациях: 0,001; 0,01 и 0,1 мг/мл. Контролем служила та же суспензия спор, инкубированная в водных растворах для инъекций, но без действующего вещества – анестетика (для лидокаина 0,8 мг/мл, а для ропивакаина и бупивакаина 0,6 мг/мл хлорида натрия) (далее – контроль 1). Все исследования проводили в трёхкратной повторности.

2 серия. Исследование способности A. niger Tiegh. адаптироваться к анестетикам.

Суспензию спор A. niger известной концентрации инкубировали в течение трёх дней в водных растворах для инъекций лидокаина, ропивакаина и бупивакаина в концентрации 0,001 мг/мл. Из полученных колоний споры высевали на питательную среду с добавлением действующего вещества в концентрации 1 мг/мл. Одновременно на питательной среде с добавлением анестетика в концентрации 1 мг/мл выращивали споры гриба, не испытавшего преадаптацию. Контролем служили колонии A. niger Tiegh., выросшие на среде без добавления анестетика (из исходной чистой культуры) (далее – контроль 2).

Достоверность различий между опытом и контролем, а также антифунгальной активностью разных амидных анестетиков в разных концентрациях оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа и двухфакторного дисперсионного анализа [20].

Результаты исследований и их обсуждение

Первым этапом исследований стала оценка влияния водных растворов амидных анестетиков в разных концентрациях на число и диаметр колоний A. niger Tiegh. Диаметр и число колоний является показателем жизненности данного тест-объекта.

Результаты исследования влияния растворов анестетиков на число колоний A. niger Tiegh. представлены на рис. 1.

 

Рисунок 1 – Влияние анестетиков амидного ряда разной концентрации на число колоний A. niger Tiegh.

 

Как видно из полученных результатов, анестетики по-разному влияют на прорастание спор и образование колоний A. niger Tiegh. Максимальную токсичность проявил ропивакаин, достоверно уменьшая число колоний (p < 0,05). С ростом концентрации растёт токсичность анестетика. Растворы бупивакаина и лидокаина в концентрации 0,001 мг/мл оказывают стимулирующее действие на A. niger Tiegh. В наибольшей из использованных концентраций 0,1 мг/мл лидокаин так же, как и ропивакаин, ингибирует прорастание спор A. niger Tiegh. Оказалось, что изучаемый нами вид аспергилла не чувствителен к раствору бупивакаина, даже в самой высокой его концентрации. Проведённый двухфакторный дисперсионный анализ показал, что выявленные различия между действиями анестетиков достоверны (p < 0,05). Примеры различий между опытом и контролем представлены на рис. 2. Результаты исследования влияния растворов анестетиков на рост A. niger Tiegh. представлены на рис. 3.

 

Рисунок 2 – Влияние анестетиков в концентрации 1 мг/мл на число колоний и разрастание мицелия A. niger Tiegh.: А – контроль; Б – колонии, выращенные на питательной среде с добавлением ропивакаина

 

 

Рисунок 3 – Влияние анестетиков амидного ряда разной концентрации на величину диаметра колоний A. niger Tiegh.

 

Ропивакаин и бупивакаин ингибируют рост мицелия сильнее, чем лидокаин (р < 0,05). Лидокаин в концентрации 0,001 мг/мл оказывает стимулирующее действие на рост мицелия, но с повышением его концентрации наблюдается ингибирование роста аспергилла.

В целом, сравнивая число колоний и их диаметр, можно заключить, что во всех изученных концентрациях (0,001, 0,01 и 0,1 мг/мл) ропивакаин достоверно снижает как число прорастающих спор, так и интенсивность роста мицелия A. niger Tiegh., бупивакаин оказывает лишь влияние на рост мицелия, а лидокаин снижает число прорастающих спор и ограничивает рост мицелия лишь в концентрации 0,1 мг/мл.

Известно, что изменение диаметра спор говорит об их готовности к прорастанию. Обычно набухание спор связано с начальными процессами метаболизма, а некоторые известные фунгициды способны их подавлять [16, с. 97–110].

Мы провели измерение диаметра спор и обнаружили, что все исследуемые анестетики в избранных концентрациях достоверно не влияют на размер спор (рис. 4). Можно предположить, что анестетики влияют на ростовые процессы самого мицелия, не затрагивая начальные этапы прорастания спор.

 

Рисунок 4 – Влияние анестетиков амидного ряда разной концентрации на диаметр спор A. niger Tiegh.

 

Показателем комфортности размножения аспергилла является средняя толщина конидиеносцев, поэтому мы измерили толщину этих структур в опыте и контроле (рис. 5).

 

Рисунок 5 – Влияние анестетиков амидного ряда разной концентрации на толщину конидиеносцев A. niger Tiegh.

 

Как видно из полученных результатов, размеры конидиеносцев колеблются, однако ни однофакторный, ни двухфакторный дисперсионный анализ не выявили достоверных отличий от контроля, что свидетельствует об отсутствии влияния анестетиков на структуры бесполого размножения гриба.

Чтобы понять, как популяции аспергилла способны справиться с ксенобиотиками в микродозах и какие процессы при этом изменяются, мы поставили особую серию экспериментов. Для этого споры из колоний, выросших на исследуемых анестетиках в самой низкой дозе 0,001 мг/мл, мы высеяли на питательную среду, содержащую анестетики в концентрации 1 мг/мл. Последняя доза является терапевтической, поскольку применяется при местной анестезии. Результаты экспериментов суммированы на рисунках 6, 7.

Исследование преадаптации, вызванной низкой дозой анестетиков, показало, что число колоний в культурах, прошедших преадаптацию, после воздействия высокой дозой 1 мг/мл достоверно (p < 0,05) возрастает по сравнению с прямым воздействием дозой 1 мг/мл (рис. 6).

 

Рисунок 6 – Развитие адаптивного ответа A. niger Tiegh. в числе колоний при предварительном воздействии нетоксичной дозой анестетиков и последующем выращивании в высокой дозе этих же анестетиков

 

Зависимости, в которых ответ изменяется с ростом дозы, но которые не являются монотонно возрастающими или монотонно убывающими, называются немонотонными зависимостями доза-ответ. Такие эффекты наблюдались при исследовании разнообразных химических агентов: фиторегуляторов, нейропептидов, гормонов, иммунотропных препаратов, антиокислителей и других соединений [21; 22].

К таким типам воздействия относится гормезис. Например, низкое воздействие антибиотика может стимулировать рост бактерий, которые могут быть вредны для людей, но теоретически явление полезно для самих организмов. Как общая концепция, гормезис – это адаптивный ответ, который был одобрен эволюционно, поэтому является высоко консервативным [23; 24]. Причины умеренности горметической стимуляции можно объяснить, если рассматривать гормезис как реакцию сверхкомпенсации после первоначального нарушения гомеостаза. Процесс восстановления происходит в течение определённого промежутка времени и направлен на возвращение к первоначальному состоянию гомеостаза [24], поэтому адаптивный характер гормезиса не вызывает сомнений [25].

Таким образом, можно утверждать, что наблюдаемые нами изменения в числе колоний являются адаптивным ответом аспергилла к действию анестетиков. Однако мы выяснили, что изучаемые нами анестетики в выбранной концентрации не влияют на прорастание спор, поэтому необходимо исследовать, как при таком типе воздействия вещества влияют на рост мицелия. Результаты представлены на рис. 7.

 

Рисунок 7 – Развитие адаптивного ответа A. niger Tiegh. при росте мицелия при предварительном воздействии нетоксичной дозой анестетиков и последующем выращивании в высокой дозе этих же анестетиков

 

Полученные результаты свидетельствуют о том, что предварительное воздействие низкими дозами анестетиков влияет на средние фазы роста колоний. Колонии после преадаптации были меньше, чем при прямом воздействии дозой 1 мг/мл (p < 0,05), то есть мы наблюдаем эффект кумуляции. Объяснить полученные результаты можно только с использованием биохимических методов, позволяющих оценить уровень метаболизма аспергилла, что не входило в задачи данного исследования.

Парадоксальные ответы аспергилла наблюдаются и в популяциях гриба, которые показали высокую устойчивость к действию фармакологических препаратов. В природных популяциях существует отбор на устойчивые штаммы, причём этот отбор носит антропогенный характер и связан с неэффективностью известных фунгицидных препаратов. Только исследование процессов адаптации позволит понять, как происходит эволюция в популяциях аспергилла, постоянно контактирующих с людьми.

Заключение

Амидные анестетики: лидокаин, ропивакаин и бупивакаин – в исследованных концентрациях по-разному влияют на колонии аспергилла. Максимальную токсичность проявил ропивакаин. Бупивакаин же оказывает стимулирующее действие.

Анестетики ингибируют рост мицелия. Самыми сильными ингибирующими свойствами обладают ропивакаин и бупивакаин. Лидокаин ингибирует рост мицелия только в концентрации 1 мг/мл.

Анестетики достоверно не влияют на размеры спор и толщину конидиеносцев.

Преадаптация низкой дозой 0,001 мг/мл достоверно снижает число колоний под действием ропивакаина и бупивакаина. Самый сильный адаптивный ответ наблюдается у лидокаина.

Преадаптация низкой дозой не влияет на рост мицелия, что выражается в усилении токсического ответа исследуемых анестетиков, таким образом, наблюдается кумулятивный эффект. Необходимы специальные биохимические исследования для понимания наблюдаемых процессов адаптации.

About the authors

Vadim Aleksandrovich Isaichkin

Samara National Research University

Author for correspondence.
Email: vadim.isaichkin.99@mail.ru

student of Biological Faculty

Russian Federation, Samara

Ekaterina Sergeevna Selezneva

Samara National Research University

Email: catana7@yandex.ru

candidate of biological sciences, associate professor of Biochemistry, Biotechnology and Bioengineering Department

Russian Federation, Samara

Evgeniy Sergeevich Korchikov

Samara National Research University

Email: evkor@inbox.ru

candidate of biological sciences, associate professor of Ecology, Botany and Nature Protection Department

Russian Federation, Samara

References

Supplementary files