Assessment of the integrated reaction of onions of different types for the action of xenobiotics for use in ecological-genetic monitoring

Full Text

Введение

Отличительной чертой современной экологии является понимание того, что в окружающую среду постоянно попадают антропогенные ксенобиотики, способные влиять на генофонд организмов, вступивших с ними в контакт. Для оценки состояния окружающей среды проводится эколого-генетический мониторинг, включающий в себя батареи скрининг-тестов, необходимых для выявления механизмов влияния поллютантов. Это делает подобные исследования дорогими и длительными, поэтому повсеместно используются быстрые тесты, дающие комплексную оценку действия ксенобиотика. К таким тестам относится Allium-тест.

Несмотря на то, что долгое время считалось, что вид Allium cepa является эталонным [1, с. 99–112], в руководстве, разработанном Всемирной организацией здравоохранения для Allium-теста, предлагается использовать и другие виды луков рода Allium [2, с. 86–97].

При использовании разных видов рода Allium, в основном обращается внимание на качество семян: их всхожесть и однородность [3, с. 22–27], так как ранее было показано, что со временем в семенах, находящихся в состоянии покоя, наблюдается естественный мутационный процесс [4, с. 206–225].

Работ, посвящённых сравнительному анализу чувствительности разных видов рода Allium немного, а между тем назрела необходимость подбирать виды, в соответствии с задачами мониторинга природных экосистем, как подвергаемых редким воздействиям антропогенных поллютантов, так постоянным из-за нахождения экосистем вблизи с крупными городами и дорогами. В связи с тем, что растения рода Allium часто встречаются в северном полушарии [5; 6, с. 101–102; 7; 8, с. 45–51], где наблюдается максимальная концентрация различных производств и, следовательно, экосистемы постоянно находятся под антропогенным прессом, луки можно было бы использовать в эколого-генетическом мониторинге, сравнивая состояние генофонда природных популяций с результатами лабораторных исследований.

Цель исследования – сравнительный анализ чувствительности видов рода Allium к воздействию спиртовыми растворами бензотриазола в экспериментах с использованием Allium-теста.

Модельным ксенобиотиком выбран бензотриазол, широко применяемый в качестве ингибитора коррозии металлов, светостабилизаторов полимеров [9, с. 1100–1105; 10; 11, с. 75–79]. Бензотриазол и его производные проявляют генотоксичность даже в малых дозах. Так японские исследователи обнаружили в природных водоемах производные бензотриазола, которые возникли в результате биохимических превращений азокрасителей, и отметили их мутагенность [12, с. 73–80; 13, с. 105–111]. В ранее проведённых исследованиях мы уже обнаружили мутагенность бензотриазола [14, с. 221–224].

Материалы и методы

Использовали спиртовые растворы бензотриазола в концентрациях 0,0001 и 0,001 мг/мл. Растворителем служил 0,5% изопропиловый спирт.

Объектами исследования выбраны следующие виды: Allium cepa – сорт Стригуновский, Allium ramosum – сорт Джусай, Allium fistulosum – сорт Апрельский. Для всех трёх видов известно число хромосом (2n = 16) [15, с. 700–710; 16, с. 10–11; 17, с. 87–88]. Эксперимент для каждого вида ставился одновременно в трёх повторах. Для этого в три чашки Петри на фильтровальную бумагу, пропитанную 5 мл растворов бензотриазола, помещали по 30 семян. Таким образом, анализировали по 90 семян для каждого вида и для каждой концентрации. Контролем служили семена, проращиваемые в 0,5% растворе изопропанола, служившего растворителем.

Токсичность оценивали по способности растворов бензотриазола влиять на всхожесть семян и рост корней, цитотоксичность – по способности влиять на пролиферативную активность корневой меристемы, мутагенность – по числу индуцированных хромосомных аберраций с помощью метода ана-телофазного анализа [18, с. 23, 26].

Митотическую активность клеток корневой меристемы оценивали по величине митотического индекса в промилле, подсчитанного по формуле:

$МИ=\frac{\sum (П+М+А+Т)\times 1000}{\sum (И+П+М+А+Т)}$,

где П – число клеток на стадии профазы, М – число клеток на стадии метафазы, А – число клеток на стадии анафазы, Т – число клеток на стадии телофазы, И – число клеток на стадии интерфазы.

Относительную продолжительность фаз митоза, характеризующую митозомодифицирующее действие ксенобиотика, рассчитывали в процентах по формуле:

$X(\%)=\frac{\sum X}{\sum _{}(П+М+А+Т)}\times 100\%$,

где Х – определенная фаза митоза (П – профаза, М – метафаза, А – анафаза, Т – телофаза), таким образом при сравнении с контролем можно обнаружить способность соединений останавливать деление на определенной стадии митоза.

Исследовали не менее 1000 клеток для анализа пролиферативной активности в каждой серии экспериментов, для каждого вида. Для оценки мутагенности анализировали не менее 300 ана-телофаз.

Достоверность различий в чувствительности исследуемых видов луков к воздействию растворов бензотриазола оценивали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа [19, с. 159–179].

Результаты и обсуждение

Обычно в токсикологических и генетических экспериментах оценивают действие ксенобиотика в высоких дозах: LD₅₀, LD₃₀. Однако использование таких доз не позволяет выявить как различия в чувствительности между видами, так и механизмы действия соединений. Использование малых доз позволяет изучить не только ингибирующее воздействие, но и стимулирующее, иногда оказываемое ксенобиотиком. Природа стимулирующего действия малых доз генотоксикантов мало изучена. Между тем, стимуляция жизненных процессов в среде, загрязняемой потенциально токсичными соединениями, может вызвать необычные экологические последствия, и должна приниматься во внимание при установлении регламентов качества среды, а также может быть использована в качестве инструмента для управления биологическими сообществами. В связи с этим в модельных экспериментах мы использовали очень низкие дозы бензотриазола.

Изучая воздействие спиртовых растворов бензотриазола на организменном уровне, мы исследовали такие показатели как процент проросших семян и среднюю длину корней и сравнивали результаты с контрольными (см. табл. 1).

Таблица 1 – Реакция разных видов рода Allium на воздействие спиртовыми растворами бензотриазола

Как видно из полученных результатов, раствор бензотриазола в самой низкой концентрации – 0,0001 мг/мл оказывает стимулирующее действие по сравнению с контролем, увеличивая число проросших семян и длину корней на 5 день роста. Более высокая доза бензотриазола ингибирует рост, но не у всех видов, а только для A. cepa, A. ramosum. На A. fistulosum бензотриазол в двух исследованных концентрациях оказывает стимулирующее действие. Необходимо отметить, что стимуляция ростовых процессов при воздействии более высокой концентрацией менее выражено, чем низкой. Проведённый двухфакторный дисперсионный анализ показал, что выявленные различия достоверны (p < 0,01).

Чтобы выяснить причину стимуляции ростовых процессов, мы исследовали пролиферативную активность в клетках корневой меристемы луков, потому что изменение пролиферативной активности в опыте по сравнению с контролем является показателем цитотоксичности исследуемых растворов.

Результаты действия спиртовых растворов бензотриазола на митотическую активность клеток представлены на рис. 1.

Рисунок 1 – Показатели пролиферативной активности клеток корневой меристемы луков разных видов

Проведённый двухфакторный дисперсионный анализ показал, что все виды достоверно различаются в реакции клеток корней меристемы на воздействие бензотриазола (p < 0,001). Растворы бензотриазола в низкой концентрации стимулируют пролиферативную активность в клетках корневой меристемы всех видов, но сильнее всего у A. fistulosum. Оказалось, что клетки меристемы A. cepa и A. ramosum не чувствительны к действию раствора бензотриазола в более высокой концентрации, в отличие от A. fistulosum, у которого происходит ингибирование клеточного деления по сравнению с контролем.

Чтобы понять митозомодифицирующее действие растворов бензотриазола в разной концентрации, мы проанализировали относительную продолжительность фаз митоза (см. рис. 2).

Рисунок 2 – Митозомодифицирующее действие растворов бензотриазола в разных концентрациях на клетки корневой меристемы исследуемых видов лука

Полученные результаты показывают, что из всех анализируемых видов лука, только клетки меристемы A. fistulosum проявили специфическую чувствительность к воздействию бензотриазола, демонстрируя блок на стадии анафазы независимо от концентрации раствора, что косвенно подтверждается большим количеством аберраций типа «мост», индуцированных бензотриазолом. В клетках меристемы A. cepa и A. ramosum обнаруживается блок на стадии профазы только при действии бензотриазолом в более высокой концентрации. Возможно у этих видов более эффективные системы репарации. Многие генотоксиканты демонстрируют митозомодифицирующее действие, увеличивая относительную продолжительность стадии профазы [20, с. 93–98; 21, с. 21–25], что говорит о способности этих соединений вмешиваться в синтез предшественников ДНК.

Наблюдаемое митозомодифицирующее действие указывает на генотоксичность растворов бензотриазола в выбранных концентрациях.

Анализ мутагенности бензотриазола для исследуемых видов показал, что у двух видов: A. cepa и A. fistulosum возникают аберрантные ана-телофазы следующих типов: «мосты», «отставания» «обломки», у A. ramosum – только «отставания» и «обломки». Однако у A. fistulosum большую часть представляют собой мутации типа «простые мосты», «двойные мосты», у A. cepa – часто встречаются микроядра и фрагментация хромосом, никогда не встречающиеся у A. fistulosum и A. ramosum. У A. ramosum хромосомные аберрации встречаются крайне редко, как в опыте, так и в контроле.

Результаты анализа чувствительности луков разных видов к мутагенному действию бензотриазола суммированы на рис. 3.

Рисунок 3 – Количество аберрантных ана-телофаз в клетках корневой меристемы индуцированных спиртовыми растворами бензотриазола у трех видов рода Allium

Проведённый двухфакторный дисперсионный анализ показал достоверное различие в чувствительности к мутагенному воздействию бензотриазола у исследованных видов рода Allium (p < 0,001). Минимальную чувствительность к мутагенному действию бензотриазола проявил A. ramosum, максимальную – A. cepa.

Мы попытались разобраться в полученных результатах. Используемые нами концентрации очень малы, мы их выбрали в связи с тем, что очень часто в природных экосистемах остаются следовые дозы ксенобиотиков. Создав модель такого действия, мы получили парадоксальные результаты – стимуляцию некоторых процессов самой низкой дозой. Такого рода явление, описано ранее и получило название гормезис, представляющего собой двухфазную зависимость доза-эффект, при которой низкие дозы воздействующего фактора оказывают стимулирующее влияние на биологический объект, а высокие дозы – ингибирующее [22, с. 627–630]. В настоящее время механизмы и закономерности, лежащие в основе немонотонных ответов организмов, остаются неизвестными [23, с. 508–604]. Существует большое количество различных гипотез [24, с. 693–703], но большинство исследователей считают, что парадоксальные эффекты имеют адаптивный характер. Стимулирующий эффект гормезиса предлагают рассматривать как явление сверхкомпенсации, то есть избыточной активации защитных систем организма [25, с. 594–617]. Мы это наблюдали при анализе митозомодифицирующего действия раствора бензотриазола в самой низкой концентрации у двух видов: A. ramosum и A. cepa.

К сожалению, в экологии проблеме гормезиса уделяется крайне мало внимания, хотя этот феномен очень важен для решения прикладных задач. До сих пор в фитоиндикации при выборе параметров организма растений, пригодных для оценки уровня загрязнения окружающей среды, не учитывается возможность парадоксального эффекта действия изучаемого фактора, что может привести к неадекватной оценке реакции тест-объекта. Следовательно, только подбор методов, позволяющих дать интегральную оценку действия факторов, позволит разобраться в реакции организмов на антропогенный фактор.

Исследуя экосистемы, подвергшиеся антропогенному воздействию, в мониторинговых исследованиях важно использовать методы, позволяющие дать интегральную оценку видов, избранных в качестве тест-объектов. Безусловно, дикие виды рода Allium, широко распространенные в природе, могут быть использования для первичного тестирования состояния экосистем, но даже у растений одного рода существуют виды с высокой толерантностью к ксенобиотикам и виды чувствительные к ним [26, с. 84–88; 27], что также следует учитывать в мониторинговых исследованиях.

Виды рода Allium имеют большое биоресурсное значение: декоративное, пищевое, лекарственное, медоносное. Испытывая постоянное негативное воздействие антропогенной природы, луки успешно сопротивляются ему за счёт высокой экологической валентности, связанной с генетически закрепленным полиморфизмом, и способны дать адаптивный ответ [28, с. 93–109]. Последнее позволяет использовать некоторые виды для изучения механизмов адаптации. Возможно, в эколого-генетическом мониторинге необходимо использовать дикие виды в сочетании с видами, давно культивируемыми человеком и используемыми в Allium-тесте, дающем интегральную оценку реакций организмов на ксенобиотики.

Заключение

Проведённый нами анализ интегральной реакции луков разных видов на генотоксическое действие бензотриазола в низких дозах выявило нецелесообразность использования A. ramosum в качестве тест-объекта для Allium-тестов, используемых в эколого-генетическом мониторинге. Для соединений со слабой токсичностью можно использовать A. fistulosum, крайне чувствительного к митозомодифицирующему действию, А. сера можно использовать для анализа мутагенности общего загрязнения окружающей среды.

About the authors

Ekaterina Sergeevna Selezneva

Email: catana7@yandex.ru

candidate of biological sciences, associate professor of Zoology, Genetics and General Ecology Department

Sergey Vladimirovich Saksonov

Author for correspondence.
Email: svsaxonoff@yandex.ru

doctor of biological sciences, professor, acting director

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Figure 1 - Indicators of proliferative activity of cells of the root meristem of onions of different species

Download (22KB)

Indexing metadata

3. Figure 2 - Mitosis-modifying effect of benzotriazole solutions in different concentrations on the cells of the root meristem of the studied onion species

Download (29KB)

Indexing metadata

4. Figure 3 - The number of aberrant ana-telophases in the cells of the root meristem induced by alcohol solutions of benzotriazole in three species of the genus Allium

Download (15KB)

Indexing metadata