Temperature conditions optimization for storing tropical orchid seeds on the example of Eulophia streptopetala and Stanhopea tigrina

Full Text

Введение

Орхидные – одно из крупнейших семейств покрытосеменных растений во всем мире. Описано около 736 родов и 28 тыс. видов, широко распространенных в большинстве наземных экосистем, особенно в тропиках [1, p. 237; 2]. Человеческая деятельность и глобальные экологические изменения повышают угрозу исчезновения орхидеи в их естественной среде обитания [3, с. 38; 4, с. 273; 5, p. 185]. В настоящее время активно разрабатываются биотехнологические методы сохранения генофонда, а также микроклонального размножения, которые, с одной стороны, способствуют сохранению редких видов и восстановлению численности их природных популяций, с другой стороны, позволяют внедрить орхидные в коммерческое производство и садоводство [6, p. 682–683; 7, с. 750].

Наиболее удобная для хранения часть растений – семена, которые содержат уникальный набор генов. Однако сохранение в семенной форме подходит не для всех видов растений. Это относится к растениям, не имеющим семян и размножающимся вегетативно, видам, которые имеют как стерильные генотипы, так и генотипы, дающие ортодоксальные семена, и видам с семенами, которые нельзя высушить до достаточно низкого уровня влажности, чтобы обеспечить их длительное хранение [8, p. 427]. Большинство видов орхидей имеет ортодоксальные семена, и содержание влаги в зрелых семенах орхидей обычно составляет менее 13% [9, p. 122]. Проблема надежного и длительного сохранения ценного генофонда на данный момент решается путем хранения семян, клеток и микроорганов в жидком азоте [10], но данный метод требует специального оборудования, затрат, а также не лишен некоторых рисков [11, с. 6–7]. Поэтому существует и альтернатива: сохранение генофонда в условиях вечной мерзлоты [11, с. 8; 12, с. 241; 13, с. 151]. Однако неизвестно, подходят ли данные методы хранения семян для тропических орхидных [10].

Цель данной работы: определение оптимального температурного режима хранения семян орхидных в диапазоне низких температур, анализ влияния температур и сроков хранения на прорастание семян и дальнейший ход ранних стадий онтогенеза на примере Eulophia streptopetala Lindley и Stanhopea tigrina Batem ex Lindl.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служили семена тропических орхидей Eulophia streptopetala Lindley и Stanhopea tigrina Batem ex Lindl. Семена для эксперимента были предоставлены Ботаническим садом Института биологии и биомедицины ННГУ им. Н.И. Лобачевского, где оба вида успешно культивируются.

Eulophia – один из крупных родов семейства орхидных, насчитывающий более 200 видов, распространенных в тропических и субтропических регионах мира [14, p. 9]. Eulophia streptopetala – растение высотой до 1,5 м с хорошо развитыми псевдобульбами. Листья ланцетные и ребристые, 50 мм длиной и 8 мм шириной. Соцветие многоцветковое. Чашелистики зеленые с коричневато-фиолетовыми пятнами внутри, лепестки ярко-желтые снаружи и бледно-кремовые внутри, шпорец пурпурно-красный [15, p. 264]. Семена Eulophia-типа имеют шаровидно-булавовидной формы, светло-коричневого цвета. Клетки семенной оболочки продолговатые, почти прямоугольные или даже изодиаметрические, свободного межклеточного пространства между ними не бывает. Межклеточный бордюр не имеет складчатых кутикулярных утолщений, в углах между клетками могут присутствовать впадинки в форме 3-лучевых звездочек. Характерной особенностью семян Eulophia-типа является наличие утолщений на пери- и антиклинальных клеточных стенках [16, с. 208].

Род Stanhopea насчитывает около 50 видов [17, p. 610]. Stanhopea tigrina – эпифитное или литофитное растение, эндемичное для Мексики и распространенное в Восточной Сьерра-Мадре [18, p. 250]. Семена Stanhopea-типа, средние размеры 592 ± 62 × 356 ± 44 мкм. Форма семян шаровидная, внезапно сужающаяся в довольно узкую короткую трубку на микропилярном конце. Семенная оболочка прозрачная, бесцветная, тонкая, зародыш светло-желтый, почти округлый (соотношение длины и ширины 1,35). В расширенной части семенной оболочки клетки почти изоаметрические, многоугольные. Семена Stanhopea tigrina объемные, за счет большого значительного объема воздушного пространства (92,52%) [16, с. 215–216].

Перед началом эксперимента проводилась визуальная оценка семян с целью определения их пригодности в работе. Для исследования использовались зрелые сухие семена. Производилась выборка из 150 семян и при помощи микроскопа и программы eScope подсчитывалась средняя длина и ширина семян, а также наличие или отсутствие зародыша. При наличии зародыша также измерялась его длина.

При температурах −18°C, −40°C, −80°C семена замораживали в пластиковых пробирках, объемом 1,5 мл на срок 1, 3, 6 или 12 месяцев. Контролем являлись семена, хранившиеся при +4°C. По истечении срока семена извлекали из холодильника и размораживали при комнатной температуре. После разморозки определялась жизнеспособность семян методом тетразольного окрашивания. Семена помещались в 0,5%-й водный раствор тетразола на 24 часа, после чего проводился подсчет процента семян с окрашенным зародышем [19; 20, с. 111] при помощи микроскопа Ломо МПС-1.

Для культивирования Eulophia streptopetala и Stanhopea tigrina использовали агаризованную питательную среду [21]. В течение месяца растения культивировались в условиях темноты при температуре +10°C, после чего были перенесены на освещаемые стеллажи с температурой +20°C для дальнейшего культивирования. В ходе культивирования отмечались сроки смены стадий онтогенеза. На стадии протокорма высчитывалась динамика увеличения его площади. Для вычисления прогресса роста протокормов раз в неделю проводилась фотосъемка. Полученные фото обрабатывали в программе Adobe Photoshop CS3 для получения черно-белых изображений протокормов в битовом формате. Полученные фотографии анализировались при помощи программы Leafarea, которая позволяла подсчитать площадь протокома в условных единицах [22]. На ювенильной стадии (на 63-й неделе культивирования) проводился морфометрический анализ, включающий в себя замеры длины побега и количество листовых пластинок.

Также у ювенильных особей на 63-й неделе культивирования проводилось количественное содержание пигментов фотосинтеза. Содержание хлорофилла (Хл.) a и b и каротиноидов (Кар.) определяли с помощью спектрофотометра СФ2000, экстрагируя их 96% этиловым спиртом, и рассчитывали по формулам [23]:

С_Хл.a [мг/л] = 12,21 × D₆₆₃ − 2,81 × D₆₄₆;

С_Хл.b [мг/л] = 20,13 × D₆₄₆ − 5,03 × D₆₆₃;

C_Кар [мг/л] = (1000 × D₄₇₀ − 3,27 × C_Хл.a − 100 × С _Хл.b) / 229,

где D₄₇₀, D₆₄₆ и D₆₆₃ – оптическая плотность вытяжки при 470, 646 и 663 нм соответственно; С – концентрация пигмента в вытяжке, мг/л.

Установив концентрацию пигмента в вытяжке, определяли его содержание в исследуемой ткани с учетом объема вытяжки и массы пробы:

F [мг/г сырой массы] = (V × C) / P,

где: F – содержание пигмента в растительном материале, мг/г сыр. массы; V – объем вытяжки, л; С – концентрация пигмента, мг/л; Р – навеска растительного материала, г.

Рассчитали соотношение пигментов:

Хл.a / Хл.b и (Хл.a + b) / Кар.

Результаты и их обсуждение

Перед замораживанием семян проводили определение морфометрических показателей семян и зародышей визуальным методом (табл. 1). Данный метод имеет погрешности, так как не все семена, имеющие зародыши, могут быть жизнеспособны.

 

Таблица 1 – Морфометрические показатели исследуемых семян перед заморозкой

Параметр	Eulophia streptopetala	Stanhopea tigrina
Средняя длина семян (M ± m), мм	0,98 ± 0,14	0,78 ± 0,1
Средняя ширина семян (M ± m), мм	0,34 ± 0,05	0,35 ± 0,06
Средняя длина зародыша (M ± m), мм	0,37 ± 0,08	0,28 ± 0,04
Доля жизнеспособных семян, %	75	92

 

После хранения при различных температурах и разморозки семян проводили окраску тетразольным методом. Размороженные семена визуально не отличались от контрольных.

Семена Eulophia streptopetala после заморозки имели меньший процент жизнеспособных семян, чем контрольная группа, хранившаяся при +4°C (рис. 1). Спустя год хранения процент жизнеспособных семян контрольной группы снизился на 31,3%, а у группы, хранившейся при −80°C, на 34%. Больше всего показатель жизнеспособности семян снизился у группы, хранившейся при −18°C (на 55,3%).

 

Рисунок 1 – Жизнеспособность семян Eulophia streptopetala после заморозки при разных температурных режимах, определенная тетразольным методом

 

Семена Stanhopea tigrina после заморозки были более жизнеспособны, чем контрольная группа (рис. 2). Спустя год хранения семян наименьшее снижение жизнеспособности семян (на 7%) наблюдалось у группы, хранившейся при температуре −80°C, в то время как у контрольной группы семян жизнеспособность снизилась на 22%.

 

Рисунок 2 – Жизнеспособность семян Stanhopea tigrina после заморозки при разных температурных режимах, определенная тетразольным методом

 

При культивировании, вне зависимости от температурных условий хранения семян, набухание происходило у всех групп растений одновременно. У Eulophia streptopetala на 7-й неделе, у Stanhopea tigrina на 6-й неделе культивирования. Формирование протокорма у всех экспериментальных групп проходило на 10-й неделе культивирования у Eulophia streptopetala и 7–8-й неделе у Stanhopea tigrina. Это на 1–2 недели раньше, чем у контрольных групп (11-я и 9-я недели соответственно).

У Eulophia streptopetala формирование первого листа у особей из всех экспериментальных групп происходило на 58-й неделе культивирования, что на 1–2 недели раньше контроля (на 59–60-й неделе). У Stanhopea tigrina формирование первого листа происходило у контрольной группы на 17-й неделе, у растений из семян, хранившихся при температуре −80°C на 18-й неделе, а у растений из семян, хранившихся при температуре −18°C или −40°C на 19-й неделе.

Определение динамики увеличения площади протокормов проводилась только на протокормах Eulophia streptopetala, поскольку протокормы Stanhopea tigrina слишком малы для выбранной методики. Также это связано с тем, что протокормы данного вида быстро перешли в ювенильную стадию. Вне зависимости от условий заморозки у всех экспериментальных групп площадь протокормов превышала контроль. При хранении семян в течение месяца, из развившихся протокормов наибольшей динамикой роста обладали растения из группы −18°C. На 55-й неделе культивирования площадь протокормов составляла 151% по сравнению с контролем. При заморозке семян на 3 и 6 месяца, наибольший прирост площади протокормов наблюдался у группы −40°C и составил 127,1% и 165,8% соответственно. При заморозке на 12 месяцев (рис. 3) наибольшая площадь была у группы −80°C (140,3%).

 

Рисунок 3 – Скорость прироста площади протокормов, развивавшихся из семян Eulophia streptopetala после 12 месяцев заморозки

 

Условия хранения семян не повлияло на количество и размеры листовых пластинок на стадии ювенильной стадии. Анализ количественного состава пигментов показал, что на ювенильной стадии (на 8-й неделе) у Eulophia streptopetala наблюдалось снижение количественного содержания хлорофиллов по сравнению с контролем. У растений из семян, хранившихся при температуре −18°C, количество хлорофиллов a и b снизилось до 64,1% и 46,5% соответственно. У группы −40°C – на 82,9% и 69%, у −80°C – на 76,8% и 54,1%. Количественное содержание каротиноидов преимущественно увеличивалось до 121,3%, 129,5% и 138% у групп −18°C, −40°C и −80°C соответственно (рис. 4). Соотношения хлорофилла a к хлорофиллу b в группах −18°C и −80°C по отношению к контролю были повышены и достигали до 148,7% и 142,3% соответственно (рис. 5). В группе −40°C данный показатель был различен в зависимости от сроков хранения семян. Значительно снизалась доля хлорофиллов по отношению к каротиноидам, в группе −80°C до 62,4%.

 

Рисунок 4 – Пигментный состав ювенильных растений Eulophia streptopetala, выращенных из семян, подвергшихся заморозке

 

Рисунок 5 – Соотношение пигментов в ювенильных особях Eulophia streptopetala выросших из семян, подвергшихся заморозке при разных температурных режимах

 

У особей Stanhopea tigrina в стадии ювенильного побега (8 недель) наблюдалась иная картина. У всех экспериментальных групп повышается содержание хлорофиллов a и b (рис. 6). У группы −18°C до 143,3% и 189,7%, у −40°C – до 161,9% и 166,1%, у −80°C – 135,4% и 148,3%. Количественное содержание каротиноидов было так же увеличено: у группы −18°C до 150%, −40°C – 179,2%, −80°C – 186,1%. Доля хлорофиллов по отношению к каротиноидам у растений из группы −18°C возрастает до 155,3% (при сроке хранения 6 месяцев), но при более низких температурах хранения снижается (рис. 7).

 

Рисунок 6 – Пигментный состав растений Stanhopea tigrina на стадии ювенильного растения, полученных из семян, подвергшихся заморозке

 

Рисунок 7 – Соотношение пигментов в клетках листа Stanhopea tigrina на стадии ювенильного растения, полученных из семян после воздействия различных температур

 

Данные результаты исследования можно сравнить с рядом других, где были успешно проведены эксперименты по криосохранению семян орхидей, таких как Calanthe vestita Wall. ex Lindl., Encyclia cochleata (L.) Lemee [9, p. 122], Anguloa clowesii Lindl., Dendrobium ochreatum Lindl. [24, с. 178–179], Angaecum magdalenae Schltr. & H. Perrier, Trichopilia tortilis Lindl. [25, с. 932] и др. В нашем эксперименте, несмотря на хранение в условиях пониженных температур, жизнеспособность семян Eulophia streptopetala и Stanhopea tigrina существенно понижается. Выявлены различия сохранения жизнеспособности у разных видов тропических орхидей. Семена Eulophia streptopetala, хранившиеся при отрицательных температурах, утрачивали жизнеспособность быстрее, чем контрольная группа. Однако стоит отметить, что в экспериментальных группах чем ниже была температура заморозки, тем лучше сохранялась жизнеспособность семян. Можно предположить, что при еще более низких температурах (менее −80°C) можно добиться лучшей сохранности семян. Семена Stanhopea tigrina после заморозки были более жизнеспособны, чем контрольная группа. При этом чем ниже температура заморозки, тем лучше сохранялась жизнеспособность. Возможно, повреждающий эффект низких температур снижен для данного вида в связи с наличием более толстой оболочки и/или различной обводненностью семян этих видов. Таким образом, одни и те же условия хранения могут по-разному влиять на семена различных видов. Также отмечено, что при длительном хранении семян интенсивность их окрашивания снижается. Можно предположить, что семена, считавшиеся жизнеспособными, содержат повреждения или какие-либо другие изменения.

У обоих видов растений наблюдается сокращение сроков перехода растений в стадию протокорма (на 1–2 недели) по сравнению с контролем. Еще в работах Т.В. Никишиной [25] и А.С. Попова [26] предполагалось, что это было связано с изменением липидного состава мембран либо с механическим повреждением оболочки семян, что облегчает доступ к зародышу питательных веществ. Это объясняет и более интенсивное развитие протокормов (увеличение его размеров) в экспериментальных группах, по сравнению с контролем. Однако в экспериментах других исследователей данная закономерность наблюдалась не всегда. Например, протокормы Angaecum magdalenae и Miltonia flavescens × Brassia longissima, развивавшиеся из семян, подвергшихся заморозке, первые 45 дней культивирования имели больший диаметр по сравнению с контрольной группой, а к 90-му дню культивирования замедлили свой рост и были мельче контроля. А у экспериментальных протокормов Encyclia cochleata изначально было замедленное развитие по сравнению с контрольной группой [25, с. 934]. Различия наблюдаются и в скорости образования ювенильного побега. В эксперименте с Eulophia streptopetala и Stanhopea tigrina у всех групп растений образование ювенильного побега происходит в один срок и морфометрически растения идентичны.

Пигменты играют большую роль в обеспечение продуктивности роста и используются как диагностический признак, по которому можно определить физиологическое состояние растений. На стадии ювенильного побега у Eulophia streptopetala количество хлорофилла в экспериментальных группах ниже, чем у контрольной группы растений. Это может свидетельствовать о некотором повреждении или изменении фотосинтетического аппарата. Возможно, хранение семян при низких температурах вызвало повреждение исключительно на формирование хлорофилла. Каротиноиды выполняют защитную функцию, поэтому при снижении количества хлорофилла возросла их необходимость для защиты растения от излишнего освещения. У растений Stanhopea tigrina на стадии ювенильного побега наблюдалась иная картина. Возрастает количество всех пигментов по отношению к контролю. Доля каротиноидов у группы растений, хранившихся при −18°C, была заметно меньше, чем у контрольной группы, но при более низкой температуре хранения увеличивалась. Таким образом, хранение семян при низких температурах приводило к перестройке фотосинтетического аппарата у растений в дальнейшем.

Выводы

Жизнеспособность семян Eulophia streptopetala существенно снижалась к 12-му месяцу хранения в условиях отрицательных температур, и лучшем показателем обладала контрольная группа. Примененные температурные условия оказались неэффективны для хранения семян данного вида, однако есть вероятность, что использование еще более низких температур может принести положительный результат.

Жизнеспособность семян Stanhopea tigrina не изменялась при хранении при −40°C и при −80°C в течение года, а при −18°C и +4°C снижалась на 10% и 15% соответственно. Температуры −80°C и −40°C могут использоваться для сохранения семян Stanhopea tigrina до 12 месяцев.

Растения, культивируемые из ранее замороженных семян, на первых стадиях развиваются быстрее контрольной группы, однако к моменту образования ювенильного побега все морфометрические показатели выравниваются.

Наблюдается изменение содержание и соотношения пигментов, происходит незначительная перестройка фотосинтетического аппарата, не критичная для растений.

About the authors

Alena Evgenievna Makarova

National Research Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod

Email: alena.makarova.95@mail.ru

postgraduate student of Botany and Zoology Department, senior laboratory assistant of Plant Micropropagation Laboratory

Russian Federation, Nizhny Novgorod

Vera Valerievna Syrova

National Research Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod

Author for correspondence.
Email: vvsyrova@mail.ru

candidate of biological sciences, associate professor of Botany and Zoology Department, head of Plant Micropropagation Laboratory

Russian Federation, Nizhny Novgorod

Elena Olegovna Polovinkina

National Research Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod

Email: e.polovinkina@phd.unn.ru

candidate of biological sciences, associate professor of Biochemistry and Biotechnology Department

Russian Federation, Nizhny Novgorod

Aleksandr Igorevich Shirokov

National Research Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod

Email: aishirokov@mail.ru

candidate of biological sciences, associate professor of Botany and Zoology Department, director of Botanical Garden

Russian Federation, Nizhny Novgorod

References

Supplementary files