Catalase activity of herbs in conditions of urban environment pollution

Full Text

Введение

Произрастание растений в неблагоприятных условиях среды оказывает влияние прежде всего на их биохимический статус, что проявляется в изменении жизнедеятельности. Поступающие в клетки организма поллютанты могут накапливаться и вызывать различные биохимические нарушения [1]. Одним из наиболее важных процессов повреждения клеток на биохимическом уровне является перекисное окисление липидов (ПОЛ) [2].

Высокие концентрации активных форм кислорода (АФК) – гидроксильного радикала (OH*), свободных радикалов HO₂*, RO*, ROO*, супероксидного анион радикала (О₂*⁻), синглетной формы кислорода (¹O₂) и перекиси водорода (Н₂О₂) вызывают перекисное окисление липидов [3]. В отсутствие стресса содержание АФК в организме невысоки: концентрация гидроперекисного радикала составляет менее 10⁻¹¹ М, содержание супероксида составляет примерно 10⁻¹¹ М, а пероксида водорода – 10⁻⁸ М [4].

АФК обладают высокой активностью и поэтому способны вызывать нарушение структуры основных биополимеров: белков, нуклеиновых кислот, углеводов и липидов [5]. Основная опасность процессов ПОЛ состоит в увеличении проницаемости клеточных мембран для ионов водорода, что может снизить активность синтеза АТФ в клетке и вызвать энергетический голод. Кроме того, развитие ПОЛ может привести к электрическому пробою клеточной мембраны и полной потере ею барьерной функции [4; 6].

Для нейтрализации АФК и блокирования процессов ПОЛ в клетках растений действуют антиоксиданты. Антиоксидантная система состоит из неферментных компонентов, таких как флавоноиды и фенолы, пролин, глутатион, аскорбиновая кислота, а также ферментных антиоксидантов: каталазы, супероксиддисмутазы и пероксидазы [7].

Каталаза и пероксидаза утилизируют перекись водорода и тем самым являются передовой линией защиты от токсического действия АФК. Они сводят концентрацию супероксид аниона и пероксида водорода в клетке до минимума и не позволяют им реагировать с образованием гидроксильного аниона [8]. Каталаза является хромопротеидом и имеет в качестве небелковой группы окисленный гем. Одна молекула каталазы способна вызвать разрушение 6 × 10⁶ молекул H₂O₂ в секунду. Однако каталаза имеет низкое сродство к перекиси водорода, из-за этого начинает функционировать только при высоком ее содержании в клетке [9].

Различными исследователями проводилось изучение влияния тяжелых металлов на активность каталазы в растениях [8–17], в том числе с использованием промышленных сточных вод [18], что доказало эффективность применения каталазы в качестве индикатора неблагоприятных условий среды. Кроме того, проводилось исследование влияния засоления почвы на активность каталазы в растениях [19]. Важность функционирования каталазы в адаптации к условиям окружающей среды было выявлено при воздействии Pb²⁺ и Cd²⁺ на Solanum lycopersicum: активность каталазы росла, несмотря на снижающуюся экспрессию соответствующих генов [20].

Однако научных работ, посвященных исследованию активности антиоксидантных ферментов в клетках растений в условиях загрязнения городской среды, которая характеризуется высокой распространенностью тяжелых металлов и других токсикантов, немного. В связи с этим целью работы стало изучение активности каталазы в различных травянистых растениях, произрастающих вблизи промышленных предприятий г. Тюмени.

Материал и методика исследований

Материал для исследования отобран в конце июля в течение 3–4 дней в различных районах города Тюмени на следующих участках:

1) контроль – луг на удалении 5 километров от антропогенных источников (участок обозначен на рисунках в статье под номером 1);

2) автотрасса Тюмень – Омск – район п. Винзили, 30 км от г. Тюмени, интенсивность движения 700 машин в час (в середине дня), удаление от автотрассы не более 30 метров (участок обозначен на рисунках в статье под номером 2);

3) УГМК – г. Тюмень, участок на удалении 200 м от предприятия «УГМК-Сталь» вблизи автотрассы (участок обозначен на рисунках в статье под номером 3);

4) УГМК 2 – г. Тюмень, участок на удалении 50 м от предприятия «УГМК-Сталь» (участок обозначен на рисунках в статье под номером 4);

5) НПЗ – г. Тюмень, участок на удалении 200 м от предприятия Антипинского нефтеперерабатывающего завода (участок обозначен на рисунках в статье под номером 5);

6) Моторостроители – г. Тюмень, участок на удалении 200 м от предприятия «Тюменские моторостроители» (участок обозначен на рисунках в статье под номером 6);

7) район аккумуляторного завода, г. Тюмень, участок на удалении 200 метров от предприятия (участок обозначен на рисунках в статье под номером 7).

На каждом участке была срезана надземная часть растений с 5 площадок. Были отобраны 5 видов растений: клевер красный (Trifolium rubens), мать-и-мачеха (Tussilago farfara), мышиный горошек (Vicia cracca), мятлик луговой (Poa pratensis), ромашка (Matricaria chamomilla). На участке № 6 ромашка не обнаружена. Площадь участков составляла не менее 100 м². На каждом участке было собрано не менее 100 растений каждого вида. Отбирали усредненную пробу методом квартования. Анализ активности каталазы в растениях проводился с помощью спектрофотометрии путем проведения цветной реакции между перекисью водорода и молибдатом аммония с измерением оптической плотности продуктов реакции на λ=470 нм [21].

Полученные результаты подвергнуты стандартной статистической обработке с использованием программного обеспечения Statistica 10. Рассчитывали среднее значение, стандартную ошибку, сравнение выборок проводили по t-критерию с уровнем доверительной вероятности P≤ 0,05.

Результаты исследований и их обсуждение

Изменение активности каталазы в клетках растений в условиях городской среды оказалось видоспецифичным (рис. 1–5).

В клетках мятлика и мышиного горошка наблюдалась тенденция к снижению активности каталазы. Активность каталазы в клетках мятлика была подавлена на участках УГМК 2 и аккумуляторного завода в 2 раза по сравнению с контролем (рис. 1). Наибольшее снижение активности фермента было отмечено на участке моторостроительного завода (более чем в 7 раз). В то же время вблизи автотрассы, а также у растений из районов УГМК и НПЗ активность каталазы оставалась на уровне контроля.

 

Рисунок 1 – Активность каталазы в клетках мятлика лугового из районов исследования.

* – статистически достоверные различия между контролем и вариантом опыта (при Р ≤ 0,05)

 

Активность каталазы в клетках мышиного горошка только вблизи автотрассы также не отличалась от контроля (рис. 2). Однако в целом для мышиного горошка наблюдалось большее количество отклонений от контроля, по сравнению с мятликом. Активность каталазы на участках УГМК, УГМК 2, Моторостроители, аккумуляторный завод, НПЗ была снижена на 30–40%.

 

Рисунок 2 – Активность каталазы в клетках мышиного горошка из районов исследования

 

Снижение активности каталазы может быть вызвано как повреждением структуры фермента, так и нарушением пути биосинтеза каталазы. Поступающие в клетки растений токсиканты могут связываться с –SH, –NH₂, –COOH группами аминокислот, входящих в состав фермента, что может привести к подавлению ферментативной активности. Кроме того, возможно опосредованное повреждение структуры фермента тяжелыми металлами и другими поллютантами, способными вызывать ПОЛ. Образующиеся активные формы кислорода (пероксид водорода, гидроксил радикал, супероксид анион, свободные радикалы, синглентая форма кислорода), которые могут окислить углеводородные цепи аминокислот в составе фермента до гидроперекисей, малонового диальдегида и оснований Шиффа. В литературе сообщалось об отрицательном влиянии Cd на активность каталазы в проростках пшеницы, что также сопровождалось ростом концентрации продуктов перекисного окисления липидов [9]. Снижение активности каталазы в ответ на загрязнении среды кадмием в клетках кресс-салата также было выявлено в исследовании О.А. Науменко с соавторами [13].

Если поступающие в клетку токсиканты имеют близкий ионный радиус к радиусу иона Fe²⁺ и необходимое сродство к образованию порфириновых комплексов (например, Cu²⁺), то также возможно замещение иона Fe²⁺ в составе гема – простетической группы каталазы, что, безусловно, скажется на ферментативной активности и, скорее всего, приведет к ее подавлению. Все вышеописанное может быть применено и к ферментам, участвующим в биосинтезе каталазы, повреждение их структуры и подавление их активности скажется на снижении концентрации каталазы в клетке.

Картина по изменению активности каталазы в объектах исследования: мать-и-мачехе, ромашке и красном клевере – оказалась неоднозначная. Для этих растений видоспецифичность оказалась еще более выраженной. Так, вблизи автотрассы активность каталазы в клетках мать-и-мачехи была повышена почти в 2,5 раза (рис. 3), у ромашки – в 1,4 раза (рис. 4), а в клетках клевера красного осталась на контрольном уровне (рис. 5). Аналогичный результат был получен и для участка УГМК 2: в клетках мать-и-мачехи и ромашки активность каталазы была увеличена в 2,5 раза, а в клетках клевера красного снижена почти в 1,7 раза.

 

Рисунок 3 – Активность каталазы в клетках мать-и-мачехи из районов исследования

 

Рисунок 4 – Активность каталазы в клетках ромашки из районов исследования

 

С другой стороны, для клевера красного также была отмечена резкая активация каталазы на участке НПЗ в 4,5 раза (рис. 5), что, однако, было нехарактерно для мать-и-мачехи (активность каталазы была на уровне контроля) и ромашки (активность каталазы снижена на 40%). Резкое повышение активности каталазы в клетках клевера красного было также выявлено на участке УГМК. В клетках ромашки также наблюдалось повышение активности каталазы на этом участке на 30%, в то время как для мать-и-мачехи ферментативная активность осталась без изменений. Кроме того, для клевера красного наблюдалось повышение активности каталазы вблизи аккумуляторного завода, что не было отмечено для других изученных растений. Неоднозначное воздействие поллютантов на активность каталазы было выявлено в исследовании Л.А. Кобринец [12] на примере Lupinus luteus при внесении свинца: активность каталазы в корнях снижалась, а в зеленой части – увеличивалась.

Повышение активности каталазы на участке УГМК 2 по сравнению с участком УГМК (увеличение в 2 раза) в клетках ромашки может быть связано с более высоким уровнем поступлением поллютантов в связи с непосредственной близостью к предприятию. Ранее также была обнаружена резкая активация каталазы в клетках Raphanus sativus при действии высоких доз кадмия (50 ПДК) [16].

 

Рисунок 5 – Активность каталазы в клетках клевера красного из районов исследования

 

Видоспецифическая реакция растений (в частности активности каталазы) на загрязнение городской среды может быть связана с различной антиоксидантной активностью растений, особенностями биосинтеза ферментов, в том числе антиоксидантных, а также с разными механизмами генетического регулирования в условиях стресса, то есть различной устойчивостью растений. Все вышеназванные особенности биохимии и генетики растений могут обуславливать снижение активности или, наоборот, активацию каталазы на одном и том же участке у разных видов растений. По всей видимости, одни и те же концентрации поступающих в клетку загрязнителей вблизи того же самого промышленного предприятия может оказывать различный эффект на активность каталазы, в зависимости от устойчивости растений. Из литературы известно, что полив растений растворами, содержащими Pb²⁺, Cd²⁺ и Hg²⁺, практически не сказывался на активности каталазы в Bruguiera gymnorrhiza, в то время как использование этих же растворов приводило к увеличению активности фермента в Kandelia candel [14]. Специфичность изменения активности каталазы также была выявлена при анализе лебеды садовой (Artiplex hortensis): в лебеде садовой зеленой при выращивании в почве, загрязненной Ni, Pb, Cu и Zn, наблюдалось увеличение активности каталазы, в то время как в лебеде садовой красной активность каталазы оставалась на уровне контроля [10]. Рост Eletrigia repens в почве, загрязненной Cd, приводил к увеличению активности каталазы в клетках корня более чем в 2 раза, в то время как активность фермента в листьях оставалась без изменений [17].

Повышение активности каталазы может быть обусловлено включением защитных механизмов в клетке, диктующих утилизацию генерирующегося в ходе стресса пероксида водорода. Ранее в исследовании С.В. Мурзаевой [18] было обнаружено повышение активности каталазы на 30% в пшенице, обработанной неочищенными сточными водами, содержащими высокие концентрации тяжелых металлов. Увеличение активности каталазы также наблюдалось в Zea mays при поливе раствором хлорида кадмия, причем этот эффект усиливался по мере увеличения концентрации токсиканта, что указывает на роль каталазы в борьбе с биохимическими нарушениями, вызванными при действии кадмия [15]. Аналогичный результат был получен при обработке Brassica napus нитратом свинца [8], а также у Jatropha curcas при действии Pb, Cd и Cr [11]. Рост Phaseolusvulgaris в условиях засоления NaCl сопровождался увеличением активности аскорбатпероксидазы, глутатионредуктазы, а также каталазы [19]. Кроме того, рост активности каталазы вблизи металлургического предприятия может быть связан с поступлением в клетку Fe, входящего в состав гема, необходимого для работы каталазы. В ранее проведенном нами исследовании была обнаружена активация каталазы в клетках овса при модельном загрязнении органогенной почвы Fe и Mn [22]. Усиление активности пероксидазы может быть связано с изменением ее компонентного состава. Ферменты находятся в клетках как в свободном, так и в связанном состоянии, а при действии стресса происходит увеличение доли их свободных форм из-за освобождения связанных [16].

В связи с наблюдаемой видоспецифической ответной реакцией растений сложно выделить те участки, загрязнители которых оказывали наибольшее влияние на активность каталазы. Однако в целом в первую очередь стоит отметить металлургический завод: участок УГМК 2 и в меньшей степени участок УГМК. Участок УГМК 2 оказался единственным из всех исследуемых районов, на котором было обнаружено изменение активности каталазы у всех изученных растений. Наименьший эффект на активность каталазы был зафиксирован в районе автотрассы, а также аккумуляторного завода. Полученный эффект может быть объяснен вышеописанным поступлением Fe в клетки растений, которое непосредственно влияет на активность каталазы, как за счет возможной генерации перекисного окисления липидов, так и за счет включения в состав порфириновых комплексов. Наименьшее, по сравнению с другими участками, воздействие автотрассы на активность каталазы связано с отсутствием вблизи промышленных предприятий, в то время как все предприятия находятся вблизи различных автодорог.

Заключение

Таким образом, анализ активности каталазы в растениях вблизи различных промышленных предприятий показал видоспецифическую ответную реакцию. В клетках мятлика и мышиного горошка наблюдалась тенденция к снижению активности каталазы, в то время как в клетках мать-и-мачехи, клевера красного и ромашки наблюдалось как снижение активности фермента, так и активация каталазы. Видоспецифичность может быть вызвана различным синтезом и функционированием антиоксидантных систем в клетках, а также особенностями генетического аппарата. Было показано, что поллютанты всех изученных предприятий в той или иной степени вызывают стресс для растений, что приводит к изменению активности каталазы. Однако наибольшее влияние на активность каталазы оказал металлургический завод, что может быть вызвано сродством поступающего в клетки растений железа с каталазой.

About the authors

Alexander Sergeevich Petukhov

Tyumen State University

Email: gpetuhova1@mail.ru

master student of Organic and Ecological Chemistry Department

Russian Federation, Tyumen

Nikolay Aleksandrovich Khritokhin

Tyumen State University

Email: kna@utmn.ru

candidate of chemical sciences, professor of Inorganic and Physical Chemistry Department

Russian Federation, Tyumen

Tatyana Anatolyevna Kremleva

Tyumen State University

Email: kreml-ta@yandex.ru

doctor of chemical sciences, head of Organic and Ecological Chemistry Department

Russian Federation, Tyumen

Galina Aleksandrovna Petukhova

Tyumen State University

Author for correspondence.
Email: gpetuhova1@mail.ru

doctor of biological sciences, professor of Ecology and Genetics Department

Tyumen

References

Supplementary files