Влияние питательной среды на морфологические особенности и жизнеспособность клеток микроводоросли Chlorella vulgaris Beijer

Полный текст

Введение

Одной из основных мировых проблем является обеспечение населения планеты достаточным количеством продовольствия. Поскольку прогнозируется, что к 2050 году население мира увеличится еще на 2 млрд человек, текущие оценки показывают, что для удовлетворения такого спроса недостаточно воды и пахотных земель [1, с. 79]. В связи с этим поиск альтернативных высококачественных белковых добавок в пище человека и кормах для животных, заменяющих традиционные источники белка, в настоящее время является важной задачей как для науки, так и для практики.

Одноклеточную зеленую микроводоросль Chlorella vulgaris, известную относительной простотой выращивания и высокой продуктивностью [2, p. 1674], стали включать в корма в качестве источника белка и других ценных компонентов, таких как незаменимые аминокислоты, полиненасыщенные жирные кислоты, витамины и натуральные пигменты [3, p. 13; 4 p. 116; 5 p. 1591]. Пищевая хлорелла может частично заменить сою в кормах для птицы из-за высокого содержания белка (приблизительно 50%) и сбалансированного профиля аминокислот [6, p. 119]. Помимо химического состава, усвояемость также является важным параметром, который следует учитывать при оценке питательного качества новых кормовых ингредиентов.

В настоящее время зеленую микроводоросль Chlorella выращивают в больших масштабах для различных целей, включая корма для животных, богатые белком [7; 8, p. 286–289], поскольку есть признаки того, что водоросли могут выращивать на различных типах сточных вод или ила [9, p. 1238–1244; 10, p. 431]. Некоторые исследования показали благотворное влияние этих продуктов на здоровье кишечника домашних животных [11, p. 103–104], и хлорелла уже используется в качестве источника белка в питании человека [12, p. 164–166; 13, p. 963]. Критически важные для здоровья вегетарианцев микроводоросли являются источником витамина B₁₂. Хотя некоторые зеленые водоросли кажутся автотрофными по кобаламину, часто истинным источником этого витамина являются ассоциированные бактерии [14, p. 66]. Различные микроводоросли, включая виды Chlorella, являются источниками каротиноидов [15, p. 545; 16] и ненасыщенных жирных кислот; оба пользуются большим спросом в рыбоводстве [17].

Цель исследования заключалась в изучении влияния питательной среды на морфологию и жизнеспособность клеток культуры микроводоросли Chlorella vulgaris Beijer.

Объектом исследований выступала одноклеточная зеленая микроводоросль Chlorella vulgaris Beijer.

Материалы и методика исследований

В данной работе была изучена хлорелла обыкновенная штамма Chlorella vulgaris Beijer. var. vulgaris IPPAS С-1, произведенная в ООО «Х-БИО». Для произрастания микроводоросли хлореллы выступала исходная культура клеток, которая содержалась в жидкой питательной среде ½ Тамия [18, с. 13–18]. Данная питательная среда применяется для выращивания сине-зелёных водорослей в различных разведениях при температурном диапазоне в пределах +27…+29°C и постоянном искусственном освещении 25–30 мкмоль квантов света на м² в сек. [19, с. 29].

Рассматривая морфологию и жизнеспособность клеток культуры микроводоросли Chlorella vulgaris Beijer., особое внимание было направлено на ответные фотореакции, строение клеточной структуры подвижных клеток микроводоросли с применением микроскопии при разном увеличении (×8, ×15, ×40) [20, с. 15–18].

Подсчет количества клеток хлореллы в культуральной среде осуществлялось методом микроскопирования, с использованием камеры Горяева, лабораторной посуды и приспособлений. Производился визуальный подсчет численности клеток изучаемой микроводоросли в исследуемой пробе в камере Горяева при микроскопировании (при увеличении ×40…×100). Единицей подсчета считалась одна клетка. В зависимости от плотности клеток подсчет производился либо по всему полю камеры (при малой численности), в 25 больших квадратах (при средней численности), либо по диагонали в 16 больших квадратах (при высокой численности клеток) с применением следующей формулы:

N = (1000 × n) / (S × h),

где N – количество клеток в 1 мл; 1000 – коэффициент пересчета мм³ в см³; n – количество просчитанных клеток в определенном секторе камеры Горяева; h – глубина счетной камеры 0,1 мм; S – площадь сектора (при площади «большого» квадрата 0,04 мм²).

Размер изучаемых клеток микроводоросли проводили с помощью микрометрии с использованием окулярмикрометра и шкалы объектмикрометра.

Определение характера жизнеспособность клеток изучаемой культуры микроводоросли хлореллы осуществлялось согласно разделу 4.7 СОП по характеру периодического пересева штаммов фонда коллекции IPPAS ИФР РАН [18, с. 24]. Рассматриваемую колонию клеток хлореллы пересевали в питательную среду и по окончании исследований на 14 сутки полученную в процессе роста пересеянную культуру клеток микроводоросли апробировали на уровень её жизнеспособности, то есть способности клеток хлореллы проявлять характер роста в пересеянном материале, путем изменения оптической плотности среды при значении 750 нм. Данная методика показывает различия в величине оптической плотности исследуемой культуры водоросли хлореллы при посадке в питательную среду при постановке опыта (в первые сутки) и в конце опыта (на 14 сутки) в результате роста её биомассы с помощью фотоэлектроколориметра.

Результаты исследований и их обсуждение

Одноклеточная зеленая микроводоросль Chlorella vulgaris Beijer. относится к отделу Chlorophyta, классу Euchlorophyceae, порядку Chlorococcales, семейству Chlorellaceae, подсемейству Chlorelloideae, роду Chlorella Beijer., виду Chlorella vulgaris Beijer. [21, с. 235–236].

Культура микроводоросли легко микроскопируется. Результаты наблюдений показали, что по морфологическим показателям клетки хлореллы представляет собой одноклеточную ядерную структуру с округлой или реже эллипсоидальную формами. Определяемые размеры клеточных структур показали, что клетки микроводоросли хлореллы имеют разную величину, составляющую в диаметре от 2 до 10 мкм. Структура клетки хлореллы представлена в виде тонкой гладкой целлюлозной оболочки, в цитоплазме которой погружено ядро с оформленным хлоропластом.

На рисунке 1 представлены результаты микроскопирования колоний живых клеток микроводоросли хлореллы при разных увеличениях.

Процессы культивирования хлореллы показали, что клетки микроводоросли размножаются бесполым путем за счет быстро развивающихся автоспор, образующихся в результате деления содержимого материнской клетки. Результаты наблюдений показали, что количество данных автоспор за 12 часов достигает 8 единиц. Было выявлено, что деление клеток хлореллы происходило, как правило, один раз в сутки, однако в условиях культивируемой питательной среды она была способна к более активному размножению (4–8 делений в сутки). Такой интенсивный клеточный рост обеспечивается за счет её термофильного штамма с оптимальными температурными значениями в пределах +27…+29°C [22, с. 72–73]. Наблюдения показали, что в таких параметрах регулярно пересеваемая культура микроводоросли с учетом её опережающего роста клеток на протяжении длительного времени способна содержать в своей культуре только одну систематическую форму без применения специальных приемов её очистки и стерилизации.

Дальнейшие наблюдения за изучаемой культурой показали, что клетки хлореллы способны к фотодвижению, то есть активно реагировать в ответ на действие светового стимула. Так было установлено, что у микроводоросли хлореллы проявляется светоиндуцированная активность подвижности её клеток в результате положительного фотокинеза в форме фототаксиса – движения клеток микроводоросли по направлению к освещению падающего света.

В сравнительном аспекте важным признаком выступают размеры клеточной структуры. При проведении микрометрии клеток хлореллы определялся их размер. Наблюдения показали, что большинство клеток хлореллы в видимом поле микрометрии имели размеры порядка 4–6 мкм. Подсчет количества клеток в суспензии микроводоросли показал, что в одном миллилитре культуральной среды содержится порядка 4,5 млн клеточных структур микроводоросли.

Определение концентрации микроорганизмов в питательной среде и последующий контроль состояния роста биомассы культуры штамма проводился фотокалориметрическим методом. Для этого изучаемый штамм Chlorella vulgaris Beijer. пересевали в питательную среду ½ Тамия и помещали в указанные условия роста и благоприятно способствовавшие росту биомассы микроводоросли. Проводилась оценка по изменению оптической плотности суспензии хлореллы при 750 нм при посадке в искусственную питательную среду. На рисунке 2 представлен график изменения оптической плотности культуры в процессе роста биомассы исследуемой культуры.

Результаты исследований по изучению биомассы культуры микроводоросли хлореллы показали, что определяемая оптическая плотность исследуемой культуры по окончании наблюдений на 14 сутки по сравнению с началом опыта увеличилась чуть более чем в 2 раза, что доказывает высокую жизнеспособность культуры. Это согласуется с рядом авторов [23, p. 343–344], когда при культивировании микроводоросли Chlorella pyrenoidosa также наблюдалась наивысшая плотность клеток на 8-е сутки выращивания.

Кроме того, была отмечена способность хлореллы быстро поглощать и усваивать углекислый газ и питательные вещества (например, азот и фосфор) из потоков отходов (например, дымовых газов и сточных вод) и синтезировать большое количество липидов, белков и др., что имеет большое практическое значение [24, p. 327]. А также было установлено, что фосфор оказывает гормезисное действие на микроводоросли. Незначительный его избыток в условиях ограничения азота стимулировал рост клеток Chlorella regularis и обеспечивал увеличение продукции биомассы на 10,2%, а также улучшал митохондриальную активность на 25,0% [25].

Таким образом, микроводоросль хлорелла представляет собой одноклеточный биореактор, приводимый в действие солнечным светом, который превращает углекислый газ в потенциальные белки, липиды, углеводы и ценные биологические соединения в присутствии достаточного количества азота, фосфора и некоторых микроэлементов [26, с. 295–299].

 

Рисунок 1 – Колония клеток при увеличении 8 × 10 (А), 8 × 15 (Б), 8 × 40 (В)

 

Рисунок 2 – Оптическая плотность биомассы при 750 нм исследуемой культуры Chlorella vulgaris Beijer. при посадке в искусственную питательную среду на первые сутки и по завершении опыта по её произрастанию (через 14 суток)

 

Выводы

1. Было выявлено, что деление клеток хлореллы происходило, как правило, один раз в сутки, однако в условиях культивируемой питательной среды она была способна к более активному размножению (4–8 делений в сутки). Такой интенсивный клеточный рост обеспечивается за счет её термофильного штамма с оптимальными температурными значениями в пределах +27…+29°C.
2. Клеточная структура микроводоросли хлореллы способна к фотодвижению, в результате положительного фотокинеза в форме фототаксиса – движения клеток микроводоросли по направлению к освещению падающего света.
3. Подсчет количества клеток в суспензии микроводоросли показал, что в одном миллилитре культуральной среды содержится порядка 4,5 млн клеточных структур микроводоросли.
4. Значение уровня оптической плотности по окончании наблюдений за исследуемой культурой на 14-е сутки увеличилось более чем в 2 раза, что свидетельствует о высокой жизнеспособности культуры.

Об авторах

Владимир Владимирович Зайцев

Самарский государственный аграрный университет

Email: zaycev_vv1964@mail.ru

доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой биоэкологии и физиологии сельскохозяйственных животных

Россия, Самара

Владислав Вячеславович Петряков

Самарский государственный аграрный университет

Email: petrvlad.79@mail.ru

кандидат биологических наук, доцент кафедры биоэкологии и физиологии сельскохозяйственных животных

Россия, Самара

Лилия Михайловна Зайцева

Самарский государственный аграрный университет

Email: lilyazaytseva1975@mail.ru

кандидат сельскохозяйственных наук, доцент кафедры биоэкологии и физиологии сельскохозяйственных животных

Россия, Самара

Жанылсын Нурлановна Махимова

Самарский государственный аграрный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: aslzhan-90@mail.ru

аспирант кафедры биоэкологии и физиологии сельскохозяйственных животных

Россия, Самара

Список литературы

Дополнительные файлы