The influence of the nutrient medium on the morphological features and cell viability of the microalgae Chlorella vulgaris Beijer

Full Text

Введение

Одной из основных мировых проблем является обеспечение населения планеты достаточным количеством продовольствия. Поскольку прогнозируется, что к 2050 году население мира увеличится еще на 2 млрд человек, текущие оценки показывают, что для удовлетворения такого спроса недостаточно воды и пахотных земель [1, с. 79]. В связи с этим поиск альтернативных высококачественных белковых добавок в пище человека и кормах для животных, заменяющих традиционные источники белка, в настоящее время является важной задачей как для науки, так и для практики.

Одноклеточную зеленую микроводоросль Chlorella vulgaris, известную относительной простотой выращивания и высокой продуктивностью [2, p. 1674], стали включать в корма в качестве источника белка и других ценных компонентов, таких как незаменимые аминокислоты, полиненасыщенные жирные кислоты, витамины и натуральные пигменты [3, p. 13; 4 p. 116; 5 p. 1591]. Пищевая хлорелла может частично заменить сою в кормах для птицы из-за высокого содержания белка (приблизительно 50%) и сбалансированного профиля аминокислот [6, p. 119]. Помимо химического состава, усвояемость также является важным параметром, который следует учитывать при оценке питательного качества новых кормовых ингредиентов.

В настоящее время зеленую микроводоросль Chlorella выращивают в больших масштабах для различных целей, включая корма для животных, богатые белком [7; 8, p. 286–289], поскольку есть признаки того, что водоросли могут выращивать на различных типах сточных вод или ила [9, p. 1238–1244; 10, p. 431]. Некоторые исследования показали благотворное влияние этих продуктов на здоровье кишечника домашних животных [11, p. 103–104], и хлорелла уже используется в качестве источника белка в питании человека [12, p. 164–166; 13, p. 963]. Критически важные для здоровья вегетарианцев микроводоросли являются источником витамина B₁₂. Хотя некоторые зеленые водоросли кажутся автотрофными по кобаламину, часто истинным источником этого витамина являются ассоциированные бактерии [14, p. 66]. Различные микроводоросли, включая виды Chlorella, являются источниками каротиноидов [15, p. 545; 16] и ненасыщенных жирных кислот; оба пользуются большим спросом в рыбоводстве [17].

Цель исследования заключалась в изучении влияния питательной среды на морфологию и жизнеспособность клеток культуры микроводоросли Chlorella vulgaris Beijer.

Объектом исследований выступала одноклеточная зеленая микроводоросль Chlorella vulgaris Beijer.

Материалы и методика исследований

В данной работе была изучена хлорелла обыкновенная штамма Chlorella vulgaris Beijer. var. vulgaris IPPAS С-1, произведенная в ООО «Х-БИО». Для произрастания микроводоросли хлореллы выступала исходная культура клеток, которая содержалась в жидкой питательной среде ½ Тамия [18, с. 13–18]. Данная питательная среда применяется для выращивания сине-зелёных водорослей в различных разведениях при температурном диапазоне в пределах +27…+29°C и постоянном искусственном освещении 25–30 мкмоль квантов света на м² в сек. [19, с. 29].

Рассматривая морфологию и жизнеспособность клеток культуры микроводоросли Chlorella vulgaris Beijer., особое внимание было направлено на ответные фотореакции, строение клеточной структуры подвижных клеток микроводоросли с применением микроскопии при разном увеличении (×8, ×15, ×40) [20, с. 15–18].

Подсчет количества клеток хлореллы в культуральной среде осуществлялось методом микроскопирования, с использованием камеры Горяева, лабораторной посуды и приспособлений. Производился визуальный подсчет численности клеток изучаемой микроводоросли в исследуемой пробе в камере Горяева при микроскопировании (при увеличении ×40…×100). Единицей подсчета считалась одна клетка. В зависимости от плотности клеток подсчет производился либо по всему полю камеры (при малой численности), в 25 больших квадратах (при средней численности), либо по диагонали в 16 больших квадратах (при высокой численности клеток) с применением следующей формулы:

N = (1000 × n) / (S × h),

где N – количество клеток в 1 мл; 1000 – коэффициент пересчета мм³ в см³; n – количество просчитанных клеток в определенном секторе камеры Горяева; h – глубина счетной камеры 0,1 мм; S – площадь сектора (при площади «большого» квадрата 0,04 мм²).

Размер изучаемых клеток микроводоросли проводили с помощью микрометрии с использованием окулярмикрометра и шкалы объектмикрометра.

Определение характера жизнеспособность клеток изучаемой культуры микроводоросли хлореллы осуществлялось согласно разделу 4.7 СОП по характеру периодического пересева штаммов фонда коллекции IPPAS ИФР РАН [18, с. 24]. Рассматриваемую колонию клеток хлореллы пересевали в питательную среду и по окончании исследований на 14 сутки полученную в процессе роста пересеянную культуру клеток микроводоросли апробировали на уровень её жизнеспособности, то есть способности клеток хлореллы проявлять характер роста в пересеянном материале, путем изменения оптической плотности среды при значении 750 нм. Данная методика показывает различия в величине оптической плотности исследуемой культуры водоросли хлореллы при посадке в питательную среду при постановке опыта (в первые сутки) и в конце опыта (на 14 сутки) в результате роста её биомассы с помощью фотоэлектроколориметра.

Результаты исследований и их обсуждение

Одноклеточная зеленая микроводоросль Chlorella vulgaris Beijer. относится к отделу Chlorophyta, классу Euchlorophyceae, порядку Chlorococcales, семейству Chlorellaceae, подсемейству Chlorelloideae, роду Chlorella Beijer., виду Chlorella vulgaris Beijer. [21, с. 235–236].

Культура микроводоросли легко микроскопируется. Результаты наблюдений показали, что по морфологическим показателям клетки хлореллы представляет собой одноклеточную ядерную структуру с округлой или реже эллипсоидальную формами. Определяемые размеры клеточных структур показали, что клетки микроводоросли хлореллы имеют разную величину, составляющую в диаметре от 2 до 10 мкм. Структура клетки хлореллы представлена в виде тонкой гладкой целлюлозной оболочки, в цитоплазме которой погружено ядро с оформленным хлоропластом.

На рисунке 1 представлены результаты микроскопирования колоний живых клеток микроводоросли хлореллы при разных увеличениях.

Процессы культивирования хлореллы показали, что клетки микроводоросли размножаются бесполым путем за счет быстро развивающихся автоспор, образующихся в результате деления содержимого материнской клетки. Результаты наблюдений показали, что количество данных автоспор за 12 часов достигает 8 единиц. Было выявлено, что деление клеток хлореллы происходило, как правило, один раз в сутки, однако в условиях культивируемой питательной среды она была способна к более активному размножению (4–8 делений в сутки). Такой интенсивный клеточный рост обеспечивается за счет её термофильного штамма с оптимальными температурными значениями в пределах +27…+29°C [22, с. 72–73]. Наблюдения показали, что в таких параметрах регулярно пересеваемая культура микроводоросли с учетом её опережающего роста клеток на протяжении длительного времени способна содержать в своей культуре только одну систематическую форму без применения специальных приемов её очистки и стерилизации.

Дальнейшие наблюдения за изучаемой культурой показали, что клетки хлореллы способны к фотодвижению, то есть активно реагировать в ответ на действие светового стимула. Так было установлено, что у микроводоросли хлореллы проявляется светоиндуцированная активность подвижности её клеток в результате положительного фотокинеза в форме фототаксиса – движения клеток микроводоросли по направлению к освещению падающего света.

В сравнительном аспекте важным признаком выступают размеры клеточной структуры. При проведении микрометрии клеток хлореллы определялся их размер. Наблюдения показали, что большинство клеток хлореллы в видимом поле микрометрии имели размеры порядка 4–6 мкм. Подсчет количества клеток в суспензии микроводоросли показал, что в одном миллилитре культуральной среды содержится порядка 4,5 млн клеточных структур микроводоросли.

Определение концентрации микроорганизмов в питательной среде и последующий контроль состояния роста биомассы культуры штамма проводился фотокалориметрическим методом. Для этого изучаемый штамм Chlorella vulgaris Beijer. пересевали в питательную среду ½ Тамия и помещали в указанные условия роста и благоприятно способствовавшие росту биомассы микроводоросли. Проводилась оценка по изменению оптической плотности суспензии хлореллы при 750 нм при посадке в искусственную питательную среду. На рисунке 2 представлен график изменения оптической плотности культуры в процессе роста биомассы исследуемой культуры.

Результаты исследований по изучению биомассы культуры микроводоросли хлореллы показали, что определяемая оптическая плотность исследуемой культуры по окончании наблюдений на 14 сутки по сравнению с началом опыта увеличилась чуть более чем в 2 раза, что доказывает высокую жизнеспособность культуры. Это согласуется с рядом авторов [23, p. 343–344], когда при культивировании микроводоросли Chlorella pyrenoidosa также наблюдалась наивысшая плотность клеток на 8-е сутки выращивания.

Кроме того, была отмечена способность хлореллы быстро поглощать и усваивать углекислый газ и питательные вещества (например, азот и фосфор) из потоков отходов (например, дымовых газов и сточных вод) и синтезировать большое количество липидов, белков и др., что имеет большое практическое значение [24, p. 327]. А также было установлено, что фосфор оказывает гормезисное действие на микроводоросли. Незначительный его избыток в условиях ограничения азота стимулировал рост клеток Chlorella regularis и обеспечивал увеличение продукции биомассы на 10,2%, а также улучшал митохондриальную активность на 25,0% [25].

Таким образом, микроводоросль хлорелла представляет собой одноклеточный биореактор, приводимый в действие солнечным светом, который превращает углекислый газ в потенциальные белки, липиды, углеводы и ценные биологические соединения в присутствии достаточного количества азота, фосфора и некоторых микроэлементов [26, с. 295–299].

 

Рисунок 1 – Колония клеток при увеличении 8 × 10 (А), 8 × 15 (Б), 8 × 40 (В)

 

Рисунок 2 – Оптическая плотность биомассы при 750 нм исследуемой культуры Chlorella vulgaris Beijer. при посадке в искусственную питательную среду на первые сутки и по завершении опыта по её произрастанию (через 14 суток)

 

Выводы

1. Было выявлено, что деление клеток хлореллы происходило, как правило, один раз в сутки, однако в условиях культивируемой питательной среды она была способна к более активному размножению (4–8 делений в сутки). Такой интенсивный клеточный рост обеспечивается за счет её термофильного штамма с оптимальными температурными значениями в пределах +27…+29°C.
2. Клеточная структура микроводоросли хлореллы способна к фотодвижению, в результате положительного фотокинеза в форме фототаксиса – движения клеток микроводоросли по направлению к освещению падающего света.
3. Подсчет количества клеток в суспензии микроводоросли показал, что в одном миллилитре культуральной среды содержится порядка 4,5 млн клеточных структур микроводоросли.
4. Значение уровня оптической плотности по окончании наблюдений за исследуемой культурой на 14-е сутки увеличилось более чем в 2 раза, что свидетельствует о высокой жизнеспособности культуры.

About the authors

Vladimir Vladimirovich Zaitsev

Samara State Agrarian University

Email: zaycev_vv1964@mail.ru

doctor of biological sciences, professor, head of Bioecology and Physiology of Farm Animals Department

Russian Federation, Samara

Vladislav Vyacheslavovich Petryakov

Samara State Agrarian University

Email: petrvlad.79@mail.ru

candidate of biological sciences, associate professor of Bioecology and Physiology of Farm Animals Department

Russian Federation, Samara

Lilia Mikhailovna Zaitseva

Samara State Agrarian University

Email: lilyazaytseva1975@mail.ru

candidate of agricultural sciences, associate professor of Bioecology and Physiology of Farm Animals Department

Russian Federation, Samara

Zhanylsyn Nurlanovna Makhimova

Samara State Agrarian University

Author for correspondence.
Email: aslzhan-90@mail.ru

postgraduate student of Bioecology and Physiology of Farm Animals Department

Russian Federation, Samara

References

Supplementary files