Молекулярная биология

В обзоре описаны методы исправления ошибок в синтетических олигонуклеотидах и генетических конструкциях, полученных с их помощью. Обсуждены способы выделения олигонуклеотидов с совершенной структурой из олигонуклеотидных пулов. Рассмотрены способы корректировки ошибок в структуре ДНК с помощью мисматч-специфичных эндонуклеаз и белков бактериальной системы репарации ДНК. Приведены примеры практического применения разработанных методов для исправления структуры синтезируемых генетических конструкций.

Формирование резистентности к трастузумабу при HER2-положительном раке молочной железы представляет серьезную проблему, ограничивающую эффективность таргетной терапии. В качестве модели для изучения механизмов развития устойчивости опухолевых клеток к трастузумабу выбрали HER2-положительную клеточную линию BT-474 рака молочной железы люминального B подтипа. Молекулярные механизмы резистентности изучали с использованием комплексного транскриптомного анализа, основанного на сравнении данных RNA-seq трех независимых наборов данных, включающих как чувствительные, так и резистентные к трастузумабу варианты. Проведен многоступенчатый биоинформатический анализ с последующей идентификацией регуляторных взаимодействий. В результате были идентифицированы гены с повышенной (FUCA2, HSPE1, SHLD1, NMD3) и с пониженной экспрессией (GPC5, FSTL1, ATG16L2, POLD2) в резистентных клетках. Установлены ключевые транскрипционные факторы (E2F1, MYC, YBX1, HEY1, NFIC, TFAP2A, AP-1/JUN, NCOA1), регулирующие экспрессию обнаруженных генов при развитии резистентности к трастузумабу. Выявленные изменения указывают на комплексное перепрограммирование транскрипционной активности, затрагивающее процессы, связанные с прохождением клеточного цикла, репарацией ДНК, метаболизмом и эпителиально-мезенхимальным переходом. Полученные результаты расширяют понимание молекулярных механизмов резистентности к трастузумабу и открывают перспективы для разработки новых терапевтических стратегий, направленных на преодоление лекарственной устойчивости при HER2-положительном раке молочной железы.

GTPаза Era золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus) является одним из факторов созревания рибосомы. Era участвует в поздних этапах сборки малой (30S) субъединицы рибосомы и регулирует образование целой 70S рибосомы. Исследование структуры комплекса Era и 30S субъединицы S. aureus поможет в понимании процессов созревания рибосомы и механизмов регуляции синтеза белка у этого патогенного микроорганизма. В данной работе представлены протоколы получения GTPазы Era и незрелых 30S субъединиц рибосом из S. aureus, протокол сборки их комплекса для дальнейших структурных исследований методом криоэлектронной микроскопии, а также проведен предварительный сбор данных с обработкой микрографий.

Нетрадиционные галотолерантные дрожжи Debaryomyces hansenii имеют большое значение в биотехнологии и пищевой промышленности, а в фундаментальных исследованиях служат моделью для изучения молекулярных механизмов устойчивости к повышенной солености и осмотическому давлению. Ранее нами был создан эффективный способ редактирования генома D. hansenii с помощью системы CRISPR/Cas9, появление которого стимулирует дальнейшее изучение структуры и физиологической роли путей репарации двухцепочечных разрывов ДНК у D. hansenii. Цель настоящей работы — оценить участие ключевых компонентов системы репарации двухцепочечных разрывов ДНК по механизму соединения негомологичных концов (NHEJ) в устойчивости D. hansenii к соединениям, повреждающим ДНК и вызывающим окислительный, высокосолевой и осмотический стресс. С помощью системы CRISPR/Cas9 получены мутантные штаммы с нокаутом генов DEHA2F10208g (DhKU70), DEHA2B01584g (DhKU80) и DEHA2G04224g (DhLIG4), кодирующих ключевые компоненты NHEJ. Впервые показано, что мутантные штаммы, в отличие от штамма дикого типа, чувствительны к химическим соединениям, повреждающим ДНК, а также к соединениям, вызывающим окислительный стресс. Осмотический и высокосолевой стресс, а также ванилин не вызывают существенных изменений в скорости формирования колоний мутантных штаммов. Интересно, что мутантные штаммы проявляют повышенную устойчивость к кофеину по сравнению со штаммом дикого типа. Полученные данные показывают, что система NHEJ D. hansenii играет значительную роль в ответе на ДНК-повреждающий и окислительный типы стресса. Важность системы NHEJ в процессах поддержания гомеостаза дрожжевой клетки необходимо учитывать при создании штаммов-продуцентов ценных веществ.

Несмотря на растущее количество данных о свойствах ориджинов репликации, молекулярные механизмы, лежащие в основе позиционирования комплекса ORC в геноме, ясны не до конца. Высказано предположение, что ключевыми факторами, определяющими позиционирование ORC в геноме, являются ДНК-связывающие белки, которые формируют различные регуляторные элементы ДНК, включая инсуляторы, промоторы и энхансеры, что обеспечивает связь программы репликации с различными уровнями регуляции транскрипции. Первым примером таких белков стал обнаруженный нами ранее белок Su(Hw). В ходе дальнейших работ был идентифицирован еще ряд ДНК-связывающих белков, включая CG10543, которые могут отвечать за формирование соответствующих регуляторных элементов и привлечения транскрипционных и репликационных комплексов на свои сайты связывания. Показано, что белок CG10543 дрозофилы взаимодействует c деубиквитинирующим (DUB) модулем комплекса SAGA. Сайты связывания белка CG10543 расположены преимущественно в промоторных областях активных генов и колокализуются с комплексами модификации и ремоделирования хроматина SAGA и dSWI/SNF, а также с репликационным комплексом ORC. С целью изучения роли белка CG10543 в регуляции транскрипции провели RNA-Seq-эксперимент в клетках S2 дрозофилы как в норме, так и при РНК-интерференции CG10543. Показали, что белок CG10543 влияет на транскрипцию 469 генов, причем существенная часть этих генов (23%) относится к экдизон-зависимым. Экдизон – это основной стероидный гормон дрозофилы, ответственный за метаморфоз и оказывающий существенное влияние на экспрессию множества генов в процессе развития дрозофилы. Нами показано, что сайты CG10543 колокализуются с белком CBP и гистоновой меткой H3K27Ac, что характерно для активных регуляторных элементов. Белок CG10543 также колокализуется с белком CP190, что может свидетельствовать о регуляции транскрипции посредством дальних взаимодействий между регуляторными элементами.