Application of various growth regulators in clonal micropropagation of black currant (Ribes Nigrum L.)

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

Currently, the optimization and development of new techniques for microclonal reproduction of black currant (Ribes nigrum L.) are one of the traditional objects of research of domestic and foreign scientists. It is noted that the success of reproduction depends on a number of factors: the timing of introduction into culture in vitro, the type of explants, the sterilizing agent, the composition of the nutrient medium. At the same time, the survival and growth of explants at each stage of reproduction depends not only on the salt composition of the nutrient medium, but also on growth regulators, mainly cytokines and auxins. This article discusses the theoretical aspects of the use of various growth regulators at different stages of clonal micropropagation of black currant, provides methods of microclonal reproduction developed by scientists of leading research organizations.

Full Text

Метаболические процессы в растительном организме протекают при непосредственном участии эндогенных (природные) регуляторов роста. Изучен механизм действия пяти фитогормонов (ауксин, гиббереллин, цитокинин, абсцизовая кислота и этилен). Ауксин, гиббереллин и цитокинин стимулируют рост и развитие растений, усиливают физиологические и биохимические процессы, абсцизовая кислота и этилен замедляют рост и реакции обмена веществ. [2]

Важный фактор, регулирующий морфогенез в культуре изолированной ткани, – наличие в питательной среде цитокининов и ауксинов. Известно, что черная смородина обладает пониженной реакцией на большинство регуляторов роста.

Цитокинины при клональном микроразмножении растений снимают апикальное доминирование и индуцируют развитие пазушных почек, регулируют рост соматических зародышей и формирование растений, замедляют старение органов и повышают их устойчивость к неблагоприятным условиям внешней среды. [18]

Ауксины участвуют в процессах регенерации при размножении каллусных клеток, образовании придаточных и боковых корней, луковиц, заложении вегетативных почек. Природный ауксин в растениях представлен в виде β-индолил-3-уксусной кислоты (гетероауксин) – ИУК. Для практических целей в сельском хозяйстве часто применяют синтетические ауксины, так как они в растениях не разрушаются ИУК-оксидазой. [23]

Растения смородины черной, культивируемые in vitro на питательной среде с цитокининами, в отличие от других ягодных культур, формируют короткие побеги. [13]

Российские и зарубежные исследователи рекомендуют размножать смородину черную в культуре in vitro, используя в качестве индуктора пролиферации дополнительных побегов цитокинин 6-бензиламинопурин (6-БАП, BAP) концентрацией – 0,5…2,0 мг/л среды. [12, 17, 24, 30, 31]

На этапе введения в культуру лучшие результаты были получены на среде с 6-БАП – 0,5…1,0 мг/л. [6] По данным Л.А. Леонтьевой-Орловой, при клональном микроразмножении смородины черной целесообразно добавлять его в питательную среду. [14] В зависимости от генотипа изучаемого растения можно получить два-пять и более дополнительных микропобегов, сформированных в шарообразный конгломерат. [17]

О.В. Матушкина с соавторами указывают на то, что увеличение концентрации 6-БАП до 2 мг/л вызывало повышение коэффициента размножения по сравнению с контролем (концентрация 6-БАП – 0,5 мг/л), однако это приводило к уменьшению микропобегов и снижению количества растений, пригодных к укоренению. [16]

В исследованиях, проводимых в институте плодоводства Питешти совместно с учеными станции плодоводства Клуж-Напока (Румыния), использовали разные типы эксплантов и наблюдали за скоростью размножения растений в пробирке, процентом укоренения, особенностями акклиматизации. На этапах инициации, размножения и укоренения применяли среду Мурасиге-Скуга (MS), а также Woody Plant Medium (WPM) and Driver & Kunyuki Walnut (DKW). В качестве регуляторов роста тестировали 6-бензиламинопурин (6-БАП), зеатин, тидиазурон (ТДЗ, TDZ) и 2-изопентениладенин (2-iP). Наилучшие результаты были получены при использовании MS и DKW, не содержащих гормоны. После двух месяцев культивирования у микрорастений формировались побеги (до 8 см) с междоузлиями более длинными у основания и короткими в средней и верхушечной частях, крупными листьями ярко-зеленого цвета. Регуляторы роста 6-БАП, тидиазурон, зеатин и 2-iP в различных концентрациях не способствовали разрастанию пазушных побегов, а 6-БАП и тидиазурон приводили к росту очень коротких побегов с прикорневым каллусом и деформированными листьями, непригодных для дальнейшего размножения или акклиматизации. [25]

Известно, что для действия цитокинина необходимо присутствие ауксина. От их соотношения зависит регенерационная способность генотипов. [8] Введение экзогенных ауксинов в состав питательной среды на фоне 6-БАП не способствует усилению процесса морфогенеза. [17]

И.А. Райков с соавторами указывают, что выход жизнеспособных эксплантов возможно увеличить с помощью введения в питательную среду цитокинина из ряда дифенилмочевины – форхлорфенурона N-(2-хлор-4-пиридил)-N´-фенилмочевины, CPPU (0,2 мг/л). Более высокие концентрации CPPU (0,5…1,0 мг/л) вызывали морфологические отклонения эксплантов. Культивирование первичных эксплантов целесообразно проводить на питательной среде, содержащей помимо цитокинина ауксины (ИМК, 0,05 мг/л) и гиббериллины (0,5 мг/л). Применение 6-БАП (0,2…1 мг/л) и тидиазурона (TDZ) (0,05…0,2 мг/л) показало меньшую эффективность размножения. Тидиазурон у многих растений вызывает эффект витрификации. [20, 22]

Согласно исследованиям сербских ученых, для успешного размножения растений в культуре in vitro требуется оптимизация условий на каждом этапе культивирования. Побеги черной смородины сорта Čačanska Crna после создания асептической культуры и образования розеток размножали на базальной среде Мурасиге-Скуга с различным гормональным составом. Отмечено, что побеги, растущие на среде без цитокининов (по 0,1 мг/л IBA и GA3), были длинными, хорошо развитыми и могли быть субкультивированы узловой трансплантацией (разделение на микрочеренки (верхушки побегов и сегменты стебля с одним узлом) и помещение на тот же носитель), их укореняемость достигла 100% к 28 дню. [31]

D. Ružić и T. Lazić в качестве исходного материала использовали почки с веток, срезанных во время покоя (конец января). Культивировали на среде Мурасиге-Скуга с добавлением N6-бензиладенина (BA), индол-3-масляной кислоты (IBA) и гиббереллиновой (GA3) в различных концентрациях. В фазе укоренения уменьшали содержание минеральных солей в два раза, добавляли 1,0 мг/л IBA, 0,1 мг/л GA3 и 1 г/л активного угля. [28]

Активные исследования в области клонального микроразмножения смородины черной проводят в Польше. Ученые сельскохозяйственного университета г. Кракова разработали протокол микроклонального размножения представителей родов Rubus и Ribes spp. Источники эксплантов – верхушки побегов, меристемы и покоящиеся почки. Среда на этапе инициации культуры in vitro – Мурасиге-Скуга, дополненная регуляторами роста (бензиламинопурин – 2,0 мг/л, индолил-3-масляная кислота – 0,5, гиббереллиновая – 0,1 мг/л), микроразмножения – бензиламинопурин (1,0 мг/л), индолил-3-масляная кислота (0,1 мг/л), укоренения – бензиламинопурин (2,0 мг/л) и индолил-3-масляная кислота (5,0 мг/л). [26]

Согласно методическим рекомендациям, разработанным в ФГБНУ ВНИИСПК, для размножения смородины черной целесообразно использовать среду Мурасиге-Скуга с добавлением 6-БАП, концентрацией от 0,2 до 2,0 мг/л в зависимости от пассажа. Культивирование эксплантов в колбах Эрлеймейера позволяет уже с 1-2 пассажа получить побеги, пригодные для укоренения. В качестве индуктора ризогенеза применяют ИМК (1…2 мг/л). [19, 20, 22]

По методике РУП «Институт плодоводства» (Беларусь) среда в 0-1-2-3 пассажах – Мурасиге-Скуга с 6-БАП в 0-1 пассажах и на этапе размножения (2-3) – 0,5 мг/л, элонгации (2-3 пассажи) – 1,0 мг/л. Также на этапах элонгации в состав среды вводили GA3 – 0,5 мг/л (2 пассаж) и 1 мг/л (3). При такой комбинации постепенно увеличивался коэффициент размножения, получено около 50% побегов, готовых к укоренению.

Среда Андерсона, дополненная 6-БАП (0,5…1,0 мг/л), оказалась подходящей по минеральному составу для развития растений, на Нича-Нича экспланты постепенно погибали. [12]

Л.В. Григорьева и сооавторы в своих опытах использовали два синтетических стимулятора роста из группы цитокининов (цитадеф и кинетин) и одно вещество из ауксинов (гетероауксин). Влияние концентрации регуляторов роста на коэффициент размножения смородины черной определяли на средах: 6-БАП (0,5 мг/л); 6-БАП (1,0 мг/л); ЦФ (цитадеф) 0,5 + ИУК 0,02 мг/л (гетероауксин); ЦФ 1,0 + ИУК 0,02 мг/л. На этапе укоренения ввели два вещества группы ауксинов – гетероауксин (ИУК) и индолил-3-масляную кислоту (ИМК). Наилучшие результаты показала среда Мурасиге-Скуга с добавкой цитадефа (0,5 мг/л) и гетероауксина (0,02 мг/л). Эффективное укоренение побегов смородины черной наблюдали с добавкой гетероауксина концентрацией 1,0 мг/л. [5]

Необходим поиск новых регуляторов роста, так как часто трудно подобрать оптимальное их соотношение вследствие разнокачественности эксплантов. [7]

В последнее время в дополнение к 6-бензиламинопурину для размножения растений in vitro используют метатополин – природный цитокинин, выделенный из листьев Populus × robusta). [27, 29, 32]

В своих исследованиях для микроклонального размножения черной смородины ученые применяли метатополин (0,7 и 1,5 мг/л), но бензиламинопурин оказался эффективнее. [29]

И.В. Князева, В.Н. Сорокопудов, О.А. Сорокопудова отмечают, что для беспересадочного хранения эксплантов в течение трех-четырех месяцев в межсезонный период целесообразно использовать питательную среду Мурасиге-Скуга, дополненную регуляторами роста 6-БАП (0,7 мг/л) и ИМК (1 мг/л), а также источниками углеводов (маннит или сахароза). Для длительного культивирования при комнатной температуре 22…24°С рекомендуется применять маннит пониженной концентрации (0,45%). При среднесрочном депонировании (температура – 3…6°С) оптимальный источник питания – сахароза. [10, 11]

Эффективность технологии микроклонального размножения во многом определяется способностью боковых побегов к укоренению in vitro. Успешность прохождения этапа ризогенеза зависит от культуры, сорта, условий этапа пролиферации, солевого и гормонального состава среды, количества пассажей, степени развития укореняемого экспланта. [7, 21, 22]

Для стимуляции корнеобразования культивируемых растений смородины черной in vitro оптимальные концентрации в питательной среде гормональных веществ ауксиновой природы: ИМК – 0,3…2,5 мг/л, ИУК – 0,5…1,0, ГК3 – 0,1…1,0 мг/л. Возможно укоренение побегов на среде MS с 6-БАП. Критический размер для укоренения побегов смородины черной – 1…2 см. [4, 9, 16] Корнеобразование ускоряют ИУК (3 мг/л) или ИМК (1 мг/л), но c учетом сортовых особенностей. [1]

И.А. Райков для импульсной обработки неукоренившихся растений предлагает использовать ИМК с концентрацией в растворе от 5 до 5,7 мг/л способом обмакивания с последующей высадкой в субстрат, что увеличит выход укоренившихся растений. [21]

Для успешного укоренения микропобегов черной смородины С.А. Матушкин и Л.В. Ярмоленко рекомендуют среду Кворина-Лепуавра с разбавленным составом (1/2 QL), витаминами и хелатом железа. Индуктором ризогенеза служила ИМК (1,0 мг/л). С применением разбавленной среды (1/2 MS) была более низкая результативность укоренения микропобегов. [15]

Смородина черная может легко образовывать корни и на безгормональной среде, особенно при использовании крупных растений, поэтому на заключительном этапе культивирования in vitro возможно высаживать микрочеренки на разбавленную вдвое среду без ауксинов, с добавлением витаминно-минерального комплекса Компливит (2 г/л) для усиления ростовых процессов культуры. Но качество посадочного материала может быть неудовлетворительным, образуются единичные тонкие корни каллусного происхождения. [22]

Применяют два способа стимуляции корнеобразования: предварительная обработка микропобегов регуляторами роста с последующим культивированием на безгормональной среде и введение регулятора роста непосредственно в питательную среду для укоренения, при этом стимуляторы рекомендуются только на начальных этапах ризогенеза. [3, 4, 9, 28]

×

About the authors

T. M. Khromova

Russian Research Institute of Fruit Crop Breeding

Author for correspondence.
Email: khromova@orel.vniispk.ru

PhD in Biological Sciences

Russian Federation, Zhilin village, Oryol region

L. V. Tashmatova

Russian Research Institute of Fruit Crop Breeding

Email: khromova@orel.vniispk.ru

PhD in Agricultural Sciences

Russian Federation, Zhilin village, Oryol region

O. V. Matsneva

Russian Research Institute of Fruit Crop Breeding

Email: khromova@orel.vniispk.ru
Russian Federation, Zhilin village, Oryol region

References

  1. Al’shevceva L.I. Rol’ sredy i regulyatorov rosta pri mikrorazmnozhenii chernoj smorodiny // Mikrorazmnozhenie i ozdorovlenie rastenij v promyshlennom plodovodstve i cvetovodstve. Sb. nauchnyh trudov NII im. I.V. Michurina. Michurinsk. 1989. S. 25–31.
  2. Vasilejko M.V. Regulyatory rosta rastenij i ih primenenie v rastenievodstve (literaturnyj obzor) // Subtropicheskoe i dekorativnoe sadovodstvo. 2021. № 76. S. 89–99.
  3. Vysockij V.A. Klonal’noe mikrorazmnozhenie plodovyh rastenij i dekorativnyh kustarnikov // Mikrorazmnozhenie i ozdorovlenie rastenij v promyshlennom plodovodstve i cvetovodstve. Michurinsk, 1989. S. 3–8.
  4. Golovina L.A., Ishmuratova M.M. Ukorenenie v kul’ture in vitro sortov smorodiny chernoj (Ribes nigrum L.) bashkirskoj selekcii. Biomika. 2018. T.10 (4). S. 332–335. doi: 10.31301/2221-6197.bmcs.2018- 42
  5. Grigor’eva L.V., Kulikova N.A., Gichenkova O.G. Vliyanie regulyatorov rosta pri mikroklonal’nom razmnozhenii smorodiny chernoj //Izvestiya Nizhnevolzhskogo agrouniversitetskogo kompleksa: Nauka i vysshee professional’noe obrazovanie. 2018. № 3 (51). S. 50–55.
  6. Guseva K.Yu. Ispol’zovanie klonal’nogo mikrorazmnozheniya dlya polucheniya posadochnogo materiala smorodiny chernoj (Ribes nigrum) //Innovacionnye napravleniya razvitiya sibirskogo sadovodstva: nasledie akademikov M.A. Lisavenko, I.P. Kalininoj. 2018. S. 81–85.
  7. Demenko V.I., Lebedev V.G., Shestibratov K.A. Ukorenenie-klyuchevoj etap razmnozheniya rastenij in vitro //Izvestiya Timiryazevskoj sel’skohozyajstvennoj akademii. 2010. № 1. S. 73–85.
  8. Derfling K. Gormony rastenij : Sistem. podhod; Per. s nem. N.S. Gel’man. M.: Mir, 1985. 303 s.
  9. Ishmuratova M.M., Golovina L.A. Razmnozhenie sortov smorodiny chernoj (Ribes nigrum L.) bashkirskoj selekcii v kul’ture in vitro //Vestnik Udmurtskogo universiteta. Seriya «Biologiya. Nauki o Zemle». 2017. T. 27. № 4.
  10. Knyazeva I.V., Sorokopudov V.N., Sorokopudova O.A. Elementy optimizacii tekhnologii sohraneniya smorodiny chernoj in vitro //Vestnik Krasnoyarskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. 2020. №. 6 (159). S. 48–55.
  11. Knyazeva I.V., Sorokopudov V.N., Sorokopudova O.A. Izuchenie posledstvij sohraneniya yagodnyh kul’tur in vitro na processy posleduyushchego klonal’nogo mikrorazmnozheniya //Innovations in life ssienses. 2020. S. 145–146.
  12. Kuharchik N.V. i dr. Razmnozhenie plodovyh rastenij v kul’ture in vitro. Minsk: Belaruskaya navuka. 2016. 208 s.
  13. Lebedev A.A., Skovorodnikov D.N. Optimizaciya uslovij klonal’nogo mikrorazmnozheniya Ribes nigrum L. (Grossulariaceae) // Raznoobrazie rastitel’nogo mira. 2016. № 1 (7). S. 61–64.
  14. Leont’eva-Orlova L.F. Sovershenstvovanie metoda klonal’nogo mikrorazmnozheniya smorodiny i ocenka razmnozheniya v nesteril’nyh usloviyah // Avtoref. diss. kand. s.-h. nauk. M. 1991. 22 s.
  15. Matushkin S.A., Yarmolenko L.V. Vliyanie mineral’nogo sostava pitatel’noj sredy na rizogenez yagodnyh kul’tur in vitro //Sbornik nauchnyh trudov Gosudarstvennogo Nikitskogo botanicheskogo sada. 2017. №. 144-2.
  16. Matushkin S.A. Vliyanie regulyatorov rosta na udlinenie mikropobegov sortov smorodiny chernoj //Selekciya i sortorazvedenie sadovyh kul’tur. 2020. T. 7. № 1-2.
  17. Matushkina O.B., Pronina I.N. Klonal’noe mikrorazmnozhenie plodovyh i yagodnyh kul’tur i perspektivy ego ispol’zovaniya // Osnovnye itogi i perspektivy nauchnyh issledovanij VNIIS im I.V. Michurina: sb. nauch. tr. Tambov, 2001. T 2. S. 103–115 5.
  18. Matushkina O.V., Pronina I.N., Yarmolenko L.V., Matushkin S.A. Vliyanie regulyatorov rosta na indukciyu adventivnogo organogeneza u listovyh eksplantov plodovyh i yagodnyh kul’tur in vitro // Plodovodstvo i yagodovodstvo Rossii. 2017. 48(1). S. 170–173.
  19. Metodicheskie rekomendacii po ispol’zovaniyu biotekhnologicheskih metodov v rabote s plodovymi, yagodnymi i dekorativnymi kul’turami. Ortl, GNU VNIISPK. 2005. 51 s.
  20. Rajkov I.A., Skovorodnikov D.N., Sazonov F.F. Optimizaciya razmnozheniya smorodiny chernoj v usloviyah in vitro // Biologizaciya zemledeliya v Nechernozemnoj zone Rossii: Sb. nauch. tr. Mezhd. nauch.-prakt. konf., posvyashchennoj 30-letiyu Bryanskoj GSKHA i 70-letiyu so dnya rozhdeniya Zasluzhennogo deyatelya nauki RF, doktora s.-h. n., professora V.F. Mal’ceva. 2010. S. 314–319.
  21. Rajkov I.A. Sovershenstvovanie klonal’nogo mikrorazmnozheniya mezhvidovyh form smorodiny chernoj i maliny remontantnogo tipa // Avtoref. dis. …kand. s.-h. nayk. Bryansk. 2012. 19 s.
  22. Skovorodnikov D.N., Rajkov I.A. Nekotorye aspekty ispol’zovaniya citokininov razlichnoj prirody na etape vvedeniya v kul’turu in vitro eksplantov chernoj smorodiny // Plodovodstvo i yagodovodstvo Rossii. 2009. T. XXII. № 2. S. 292–296.
  23. Subbotina N.S., Horoshkova Yu.V., Muratova S.A. Vliyanie auksinov na rizogenez ezheviki sortov Dirksen Tornless i Blek Setin v kul’ture in vitro // Sb.: Nauchnye innovacii-agrarnomu proizvodstvu: mat. Mezhd. nauch.-prakt. konferencii, posvyashchennoj. 2018. S. 933–938.
  24. Cárdenas M. J. S. Adaptación de protocolos de establecimiento in vitro de Ribes rubrum L., Ribes nigrum L., Ribes uva-crispa L: dis. – Universidad Austral de Chile, 2016.
  25. Clapa D. et al. „In vitro” propagation of black currant ‘Perla Neagra’and ‘Amurg’cultivars //Scientific Papers of the Research Institute for Fruit Growing Pitesti, Romania. 2009.
  26. Dziedzic E., Jagła J. Micropropagation of Rubus and Ribes spp //Protocols for Micropropagation of Selected Economically-Important Horticultural Plants. Humana Press, Totowa, NJ, 2012. S. 149–160.
  27. Kucharska D. et al. Application of meta-topolin for improving micropropagation of gooseberry (Ribes grossularia) //Scientia Horticulturae. 2020. T. 272. S. 109529.
  28. Ružić D., Lazić T. Micropropagation as means of rapid multiplication of newly developed blackberry and black currant cultivars //Agriculturae Conspectus Scientificus. 2006. T. 71. № 4. S. 149–153.
  29. Sachryn I., Dziedzic E. Application of m-topolin and Led Technology for Blackcurrant Propagation in Cultures in vitro // Indian Horticulture Journal. 2018. T. 8. № 2 and 3. S. 84–86.
  30. Sedlák J., Paprštein F. In vitro establishment and proliferation of red currant cultivars //Horticultural Science. 2012. T. 39. № 1. S. 21–25.
  31. Vujović T., Ružić D., Cerović R. Improvement of in vitro micropropagation of black currant ‘Čačanska Crna’ //X International Rubus and Ribes Symposium 946. 2011. S. 123–128.
  32. Zaytseva Y.G., Ambros E.V., Novikova T.I. Meta-topolin: advantages and disadvantages for in vitro propagation //Meta-topolin: A Growth Regulator for Plant Biotechnology and Agriculture; Springer: Singapore. 2021. S. 119–141.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.