Search for informative marker systems associated with loci of resistance to vascular bacteriosis in cultivated cabbage

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

This article presents the results of studies on the determination of informative DNA marker systems that provide reliable control of the presence of Xcc-loci of resistance to black rot in the breeding material of white cabbage. At the initial stage of the work, 20 molecular markers taken from the VegMarks database were tested on isogenic cabbage lines contrasting in resistance to black rot (resistant line 269-Yas12p-2 and susceptible line Pi714). It was found that only the SSR marker Ol10-C01 reveals polymorphism between contrasting samples of white cabbage. PCR analysis with the use of this polymorphic marker and phytopathological testing have been also performed on F2 plants of the hybrid combination 269-Yas12p-2 × Pi714. As a result of the statistical analysis of cleavage, it was found that the SSR marker Ol10-C01 is co-inherited with a trait of resistance to black rot, since the expected segregation of F2 plants by genotype 1:2:1 according to Mendel’s law by this locus and the optimal frequency of recombination between the Xcc resistance locus and the marker (13.7%) are observed.

Full Text

Сосудистый бактериоз капусты белокочанной приводит к значительным потерям урожая (более 50%) во всем мире при наличии благоприятных условий для бактерии. [12] Это заболевание связано с поражением проводящей системы растения, при котором бактерия Xanthomonas campestris pv. campestris (Pammel) Dowson проникает в ксилему, колонизирует мезофилл и далее распространяется по тканям. Образуются хлорозные V-образные пятна, приводящие к некрозу и гибели всего растения. [8, 13, 14] Составление алгоритма мероприятий по предупреждению данной болезни – трудоемкий процесс, так как расовый состав патогена очень разнообразен. Выявлено 11 рас Хсс, из которых на Юге России самые распространенные и опасные 1 и 4 расы. [3, 7, 15] В селекции капусты белокочанной (B. oleracea) источники устойчивости к основным поражающим расам Xсс (1 и 4) присутствуют чаще у геномов A и B (B. rapa и B. nigra), редко встречаются в геноме С (B. oleracea). [11] Например, в работе Sharma et.al. (2016) идентифицирован ген устойчивости к 1 расе патогена Xca1bc и имеются эффективные маркеры для его определения. [11] Для B. oleracea изучение закономерностей наследования устойчивости к сосудистому бактериозу затруднено, так как оно носит полигенный характер. [6] В работе Lee (2015) на восьми хромосомах из девяти у B. oleracea было картировано 14 ассоциированных с устойчивостью к Xcc QTL, четыре из них относились к основным локусам, влияющим на признак. [9] Tonu et al. (2013) выявил наиболее значимые QTLs: главный Хсс Во (Reiho) 1, минорные Хсс Во (Reiho) 2 и Хсс Во (GC1), а также ближайшие маркеры к этим локусам. [13] Afrin et al. (2018) некоторые из этих маркеров (9 SSR и 1 InDel) апробировали на 27 инбредных линиях капусты, устойчивых к разным расам патогена. Результаты сопоставления молекулярного скрининга и фитопатологических тестов позволили отобрать пять маркеров, способных отличать устойчивые формы от поражаемых. [6] Однако универсальную ДНК-маркерную систему на такой сложный полигенный признак создать к данному моменту не удалось. Поэтому проведение молекулярно-генетических исследований, связанных с поиском и разработкой эффективных молекулярных маркеров остается актуальной проблемой для генетики и селекции капусты белокочанной, решение которой позволит сократить некоторые этапы селекционного процесса, получить ценные устойчивые генотипы с нужными биологическими свойствами.

Цель работы – определение информативных ДНК-маркерных систем, сцепленных с признаком устойчивости к сосудистому бактериозу у капусты белокочанной.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования – контрастные формы капусты белокочанной (устойчивая изогенная линия 269-Яс12п-2 и восприимчивая Пи714) к сосудистому бактериозу, а также 102 растения поколения F2 гибридной комбинации 269-Яс12п-2 х Пи714, отобранные в отделе овощекартофелеводства ФГБНУ «ФНЦ риса».

ДНК из листьев капусты выделяли по схеме Мюррея и Томпсона c использованием цетилтриметиламмоний бромида (СТАВ) в качестве лизирующего буфера растительных клеток. [10]

В ходе молекулярно-генетических исследований по идентификации аллелей устойчивости к сосудистому бактериозу у капусты белокочанной применяли нейтральные кодоминантные микросателлитные (SSR) маркеры, взятые из базы данных VegMarks на сайте https://vegmarks.nivot.affrc.go.jp/VegMarks/app/page/home. Нуклеотидные последовательности праймеров представлены в таблице 1.

 

Таблица 1.

Нуклеотидная последовательность праймеров для капусты белокочанной

Маркер

Дизайн последовательности праймеров

AF458409

F- AGAAAGCAGACGGGAATGG

R- TGGTTAAAGCGAAAGTGTGC

BZ523957

F- ATTATGACGCCTGGTTTTA

R- TTGGTTAGAAGTTATGGGAAC

CC969431

F- AAGCCACCTCACCTTAGCC

R- GAAATCCCAGAGACTGAAAACC

CC969459

F- CCAAAGATTCAGAGGAAATGG

R- GCGTCAAAAACGGTGTCG

Ol10-B04

F- ATCTTCCTCCACGTTCATGC

R- CGAATCTTGAAGTTCTGACCC

Ol10-B08

F- AAGCTGTTCGATGAAATGCC

R- ACTTGTTTGCATCCATTGCC

Ol10-C01

F- ATGACTGCTTAAACAGCGCC

R- CTTCTCCAACAAAAGCTCGG

Ol10-C10a

F- AAGAAGGCGTAGAGATTGCC

R- GCAGATAAGATTCGAGTCCCC

Ol10-C10b

F- AAGAAGGCGTAGAGATTGCC

R- GCAGATAAGATTCGAGTCCCC

Ol10-D01

F- TCTCTGCCAAAAGCAAATAGC

R- CTTGGCTCTCTCTCACCACC

Ol10-D02

F-CATTTCTCAATGATGAATAGTTTTGG

R- CCATTGATATGGAGATGGGG

Ol10-D08

F- TCCGAACACTCTAAGTTAGCTCC

R- GAGCTGTATGTCTCCCGTGC

Ol10-F06

F- CATTGGTTTAGTCATTTCGTCG

R- AATTCAAAAACTGCCGAACG

Ol10-G05

F- TCAATGCTCTTGTAGTCTTTGACC

R- AGAATGAGAGCGTGGAGAGG

Ol11-B05

F- TCGCGACGTTGTTTTGTTC

R- ACCATCTTCCTCGACCCTG

Ol11-H06

F- TCCGAACACTCTAAGTTAGCTCC

R- TTCTTCACTTCACAGGCACG

Ol11-H09

F- CCCTTTTCCCCTTCTATTGG

R- GTGCGACTTGGAATTTCTCC

Ol12-A04

F- TGGGTAAGTAACTGTGGTGGC

R- AGAGTTCGCATACTCTGGAGC

Ol12-G04

F- CGAACATCTTAGGCCGAATC

R- GGTTAACCTGCGGGATATTG

Ol13-C12

F- AGAGGCCAACAAAGAACACC

R- GAAGCAGCACCAGTGACAAG

 

Амплификацию ДНК проводили в амплификаторах Терцик и Bio Rad с оптимизацией условий ПЦР. При апробации маркеров из базы данных VegMarks использовали протокол амплификации с градиентом температуры отжига праймеров: первичная денатурация – 15 мин. при 95°С; денатурация – 2 мин., 94°С; следующие 25 циклов: денатурация – 2 мин., 94°С, 1 мин., отжиг праймеров – 30 с при 65°С, синтез – 45 с, 72°С; затем каждый второй цикл температуру отжига понижают на 1°С до достижения температуры 55°С и остальные 20 циклов: денатурация – 1 мин., 94°С, отжиг праймеров – 30 с, 55°С, синтез – 45 с, 72°С, завершающий цикл синтеза – 1 мин. при 72°С.

Разделение продуктов амплификации осуществляли методом электрофореза в 2%-ом агарозном геле (80 мин.) при напряжении 130. [4] Визуализация результатов электрофореза в УФ-свете с использованием гельдокументирующей системы GelDocXR+.

Для фитопатологического тестирования на устойчивость к сосудистому бактериозу проводили инокуляцию растений капусты белокочанной в фазе 5…7 листьев путем опрыскивания в стадию гуттации водной суспензией бактерий. Для заражения брали изоляты Xanthomonas campestris pv. campestris (Pammel) Dowson местной популяции патогена, относящиеся к самой распространенной в Краснодарском крае расе 1. Оценивали поражаемость образцов в динамике роста и развития растений по пятибалльной шкале Студенцова через 14 дн. после инокуляции. [2] При подсчете результатов фитопатологического тестирования на устойчивость к сосудистому бактериозу растения, имеющие степень поражения 2…4 балла, считались неустойчивыми по фенотипу, 0…1 балл – устойчивыми.

Чтобы оценить значимость различий в расщеплении в сегрегирующих популяциях между фактическим числом растений в выборке и теоретически ожидаемым использовали метод χ2 (хи-квадрат). [1]

Частоту рекомбинации между локусом устойчивости к сосудистому бактериозу Хсс и молекулярными маркерами рассчитывали, как отношение числа растений с наличием или отсутствием ДНК-маркера, несоответствующих фенотипическому проявлению признака устойчивости к фузариозу к общему числу растений, умноженное на 100. [5]

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе работ в молекулярно-генетических исследованиях по выявлению информативных ДНК-маркерных систем для идентификации аллелей устойчивости к сосудистому бактериозу SSR-маркеры, взятые из базы данных VegMarks, были апробированы на контрастных по резистентности к сосудистому бактериозу изогенных линиях капусты белокочанной (табл. 1). Из этих маркеров информативным оказался только Ol10-С01 (рис. 1, 2-я стр. обл.).

На следующем этапе исследований данный полиморфный маркер апробирован на 102 растениях сегрегирующей популяции F2 для изучения его сонаследования с признаком устойчивости к сосудистому бактериозу (рис. 2, 2-я стр. обл.).

На электрофореграмме заметно, что уже среди первых проанализированных 15 растений поколения F2 по локусу Ol10-С01 выявлены все виды генотипов. Растения № 10, 11, 15 – гомозиготы по рецессивной аллели (несут аллель устойчивости размером 234 п.н.), № 2, 8, 9 – гомозиготны по доминантной аллели восприимчивости размером 217 п.н., № 1, 3…7, 12…14 – гетерозиготны.

Одновременно с ДНК-анализом для проверки информативности отобранных маркеров проводили фитопатологическое тестирование этих же растений сегрегирующих популяций. Оценивали поражаемость образцов сосудистым бактериозом в динамике роста и развития растений по шкале Студенцова. [2] По результатам фитопатологического тестирования установлено, что симптомы поражения сосудистым бактериозом у растений гибридной комбинации 269-Яс12п-2 × Пи714 соответствовали 1 и 2 баллам (рис. 3, 2-я стр. обл.).

На рисунке 3 А (2-я стр. обл.) видны усыхания отдельных мелких пятен на краях пластинок листьев (1 балл поражаемости) крупные усыхания бурого или коричневого цвета, имеющие V-образную форму, окаймленную узким светло-зеленым ореолом отмирающих клеток, что соответствует 2 баллам поражаемости (рис. 3 Б, 2-я стр. обл.).

На заключительном этапе исследования сравнивали результаты ПЦР по локусу Ol10-C01 растений сегрегирующей популяции с результатами фитопатологического тестирования для установления сонаследования данного маркера с признаком устойчивости к сосудистому бактериозу (табл. 2).

 

Таблица 2.

Анализ сонаследования SSR-маркера среди растений сегрегирующей популяции F2

Маркер

F2-растения гибридной комбинации 269-Яс12п-2 х Пи714

Частота рекомбинации, %

Сегрегация растений

Маркер / Устойчивость к фузариозу

по генотипу

по фенотипу

+ : ±: -

χ2

R:S

χ2

R/+

S/+

R/-

S/-

Ol10-C01

26:52:24

0,23

40:62

10,1

40

38

0

24

13,7

Примечание. R – устойчивость; S – неустойчивость; «+» – присутствует молекулярный маркер, «-» – отсутствует. Для уровня значимости p=0,05 и d.f. =1 критическое значение χ2(крит.)=3,84, d.f. = 2 χ2(крит.) = 5,99.

 

Растения F2 по локусу Ol10-С01 имеют соотношение по генотипу 26:52:24, что соответствует менделевскому закону расщепления 1:2:1 и подтверждается статистическим анализом (χ2 = 0,23 < χ2(крит.) = 5,99). Окончательное соотношение по фенотипу – 40 (устойчивые): 62 (неустойчивые), что не удовлетворяет менделевскому 3:1, так как устойчивость к сосудистому бактериозу обладает полигенным рецессивным характером наследования (χ2 = 10,1 > χ2(крит.) = 3,84. [8] Была рассчитана частота рекомбинации между локусом устойчивости к сосудистому бактериозу Хсс и маркером Ol10-C01, обнаружено, оптимальное значение по локусу (менее 20%), что говорит о сцепленном наследовании данного маркера с признаком устойчивости к сосудистому бактериозу.

Таким образом, из всех проанализированных маркеров только SSR-маркер Ol10-С01 – информативный кодоминантный, сонаследуемый с признаком устойчивости к сосудистому бактериозу. Он будет включен в селекционный процесс для ускоренного создания устойчивых генотипов капусты белокочанной к сосудистому бактериозу на юге России, с повышенной урожайностью и нужными селекционеру биологическими свойствами.

 

×

About the authors

E. V. Dubina

Federal Scientific Rice Centre

Author for correspondence.
Email: lenakrug1@rambler.ru

Grand PhD in Biological Sciences, Professor of the RAS

Russian Federation, Krasnodar

Yu. A. Makukha

Federal Scientific Rice Centre

Email: lenakrug1@rambler.ru

PhD in Biological Sciences

Russian Federation, Krasnodar

S. V. Garkusha

Federal Scientific Rice Centre

Email: lenakrug1@rambler.ru

Corresponding member of the RAS

Russian Federation, Krasnodar

O. L. Gorun

Federal Scientific Rice Centre

Email: lenakrug1@rambler.ru

Junior Researcher

Russian Federation, Krasnodar

S. A. Lesnyak

Federal Scientific Rice Centre

Email: lenakrug1@rambler.ru

Junior Researcher

Russian Federation, Krasnodar

References

  1. Batin N.V. Komp’uterniy statisticheskiy analiz dannykh. Minsk, 2008. 160 s.
  2. Koroleva S.V., Dyakunchak S.A., Sitnikov S.V. Immunologicheskaya otsenka selektsionnogo materiala pri sozdanii gibridov F1 belokochannoy kapusty s gruppovoy ustoychivost’yu k fusariozu i sosudistomu bakteriozu (metodicheskie rekomendatsii). M., 2012. 16 s.
  3. Koroleva S.V., Dyakunchak S.A., Yurchenko S.A. Development of F1 hybrids of cabbage with complex resistance in the south of Russia. Vegetable crops of Russia. 2019; 4: 16–20. https://doi.org/10.18619/2072-9146-2019-4-16-20
  4. Kutlunina N.A., Ermoshin A.A. Molekulyarno-geneticheskie metody v issledovanii rasteniy. Ekaterinburg, 2017. 142 s.
  5. Nguen M.L., Monakhos G.F., Komakhin R.A., Monakhos S.G. New resistance locus to clubroot in chromosome A05 of Chinese cabbage (Brassica rapa L.) // Rus. J. Genetics. 2018. V. 54. № 3. P. 306–315.
  6. Afrin K.S., Rahim M.A., Park J. et al. Screening of Cabbage (Brassica oleracea L.) Germplasm for Resistance to Black Rot. Mol. Biol. Rep. 2018. No. 5. PP. 773–785. https://doi.org/10.1007/s11033-018-4217-5
  7. Cruz J., Tenreiro R., Cruz L. Assessment of Diversity Xanthomonas campestris Pathovars Affecting Cruciferous Plants in Portugal and Disclosure of two novel Xcc races. Plant Pathol. 2017. No. 9. PP. 403–414 https://doi.org/10.4454/jpp.v99i2.3890
  8. Kifuji Y., Hanzaea H., Terasawa Y., Nishio T. QTL analysis of black rot resistance in cabbage using newly developed EST-SNP markers. Euphytica. 2013. No. 190. PP. 289–295. https://doi.org/10.1007/s10681-012-0847-1
  9. Lee J., Izzah N.K., Jayakodi V. Genome-wide SNP identification and QTL mapping for black rot resistance in cabbage. BMC Plant Biol. 2015. No. 15 (32). P. 11. https://doi.org/10.1186/s12870-015-0424-6
  10. Murray M.G., Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research. 1980. V. 10. P. 4321–4325.
  11. Sharma B.B., Kalia P., Yadava D.K. et al. Genetics and molecular mapping of black rot resistance locus Xca1bc on chromosome B-7 in Ethiopian mustard. PLoS ONE. 2016. No. 11 (3). P. 13. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0152290
  12. Singh D., Raghavendra B.T., Singh P. et al. Detection of black rot disease causing pathogen Xanthomonas campestris pv. campestris by bio-PCR from seeds and plant parts of cole crops Seed Sci. & Technol. 2014. No. 42. PP. 36–46. http://doi.org/10.15258/sst.2014.42.1.04
  13. Tonu N.N., Doullah M.A., Shimizu M. et al. Comparison of Positions of QTLs Conferring Resistance to Xanthomonas campestris pv. campestris in Brassica oleracea. American Journal of Plant Sciences. 2013. No. 4. PP. 11–20. http://dx.doi.org/10.4236/ajps.2013.48A002
  14. Vicente J.G., Holub E.B. Xanthomonas campestris pv. campestris (cause of black rot of crucifers) in the genomic era is still a worldwide threat to brassica crops. Mol. Plant Pathol. 2013. No. 14 (1). PP. 2–18. https://doi.org/10.1111/j.1364-3703.2012.00833.x
  15. Vo Thi Ngok Ha, Dzhalilov F.S., Mazurin E. et al. Use of essential oils for disinfection of cabbage seed from black root Zasch. Kart. 2014. No. 2. PP. 26–28 http://www.kartofel.org/zakart/zakart2_2014.pdf

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Figures for the article by E.V. Dubina et al. "Search for informative marker systems associated with loci of resistance to vascular bacteriosis in cabbage" (p. 15)

Download (535KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.