Water biotesting of Lake Imandra (Murmansk Region) using Allium test

Full Text

Введение

Мурманская область – промышленно развитый район России. Горно-обогатительные и другие предприятия являются градообразующими (АО «Апатит», АО «СЗФК», АО «Кольская ГМК», АО «Олкон», АО «Ковдорский ГОК», ООО «Ловозерский ГОК») [1, с. 39].

Минеральное сырье Хибинского массива чрезвычайно ценно, десятая часть всех известных минералов в мире найдена на Кольском полуострове, более сотни из них более нигде в мире не встречаются. Также на территории сосредоточено 25% мировых запасов редкоземельных элементов [2, с. 163].

Такая долговременная техногенная нагрузка не могла не отразиться на экологическом состоянии окружающей среды региона, в частности, на состоянии водных источников. Внутренние водоемы в Арктике являются чувствительными объектами и испытывают массированное антропогенное воздействие уже более полувека.

Разработка полезных ископаемых на территории Мурманской области, начавшаяся с 30-х гг. XX века, строительство ГЭС и АЭС и общее антропогенное влияние повлекло за собой накопление на водосборах огромного количества отработанных руд, распространение аэротехногенных выбросов на большие территории, изменение морфологических характеристик водоемов, эвтрофирование вод и т.д. [3, p. 923]. В плане изучения последствий техногенного воздействия представляет интерес озеро Имандра.

Имандра – самый крупный водоем в Мурманской области. Озеро состоит из трех обособленных (Большая, Йокостровская и Бабинская Имандра) плесов, соединенных узкими проливами [4, с. 6–8]. Из-за узких проливов и особенностей физико-географического положения, озеро можно условно разделить на три «отдельных» водоема, которые испытывают как различную антропогенную нагрузку, так и влияние факторов среды, что представляет интерес для экологических и других исследований. Полный обмен воды в озере происходит примерно за 2 года. Из озера вытекает единственная река Нива.

Имандра уже долгое время подвергается загрязнению (достигшего максимума в 1970-е гг. XX века) стоками предприятий горнодобывающей и металлургической промышленности. Дополнительную нагрузку на озеро вносят хозяйственно-бытовые стоки и возникающие иногда стихийные накопления мусора.

Деятельность Кольской АЭС привносит тепловое загрязнение вод губы Молочной, в результате которого изменился химический состав воды, и произошло частичное эвтрофирование этой части озера. Увеличение температуры происходит локально для губы Молочной и прилегающей акватории. Воды, поступающие из Йокостровской Имандры, нагреваются выше других участков на 5–13°C в зависимости от сезона года. Также варьируется и территория незамерзающей полыньи от 2 до 12 км² в зависимости от интенсивности прогрева. На остальной территории сохраняется естественный температурный режим (от 0 до +18°C в зависимости от сезона года и установления/схода льда) [5, с. 48].

Исследуемые станции (рис. 1) находятся в зоне транзитных течений (о-в Ерм, пролив Широкая Салма, губа Зашеечная, водозабор Кольской АЭС), вместе с которыми происходит миграция веществ из более загрязненных участков озера, а губа Кунчаст является условно фоновой точкой, но подвергается аэротехногенному загрязнению. Отдельным негативным фактором является накопление тяжелых металлов в донных отложениях из-за речных притоков и смешения вод из губы Монче с открытой частью Большой Имандры [5, с. 10, 19, 48].

 

Рисунок 1 – Карта озера Имандра и район исследования. Цифрами указаны точки отбора проб воды: 1 – губа Кунчаст; 2 – о-в Ерм; 3 – пролив Широкая Салма; 4 – губа Зашеечная; 5 – водозабор «Кольской АЭС» (западный берег губы Зашеечной)

 

К антропогенному воздействию присоединяется изменение климата [6, с. 420], что приводит к снижению качества вод, изменению биоразнообразия озера, что, в свою очередь, порождает необходимость проведения различных экологических исследований.

В настоящее время продолжается развитие программ мониторинга экологического состояния водных источников как с точки зрения изучения химического состава вод и донных отложений, так и с помощью использования тест – систем in vivo для биоиндикации и биотестирования. Биотестирование является удобным и чувствительным методом, поскольку химические вещества, поступающие в водные источники, могут действовать аддитивно, в синергии или подавлять действие друг друга, что может приводить к нарушениям процессов метаболизма в живых тест-системах.

Для биотестирования вод используются различные тест-организмы: дафнии (Daphnia magna Straus) [7, с. 68; 8, p. 2] как один из самых известных и основополагающих, водоросли, инфузории, бактерии и др.

Многие высшие растения также нашли свое применение не только в методиках биотестов в виде фитотестирования [9, с. 2], но и для цитогенетического анализа. Меристема корня многих видов высших растений, например, бобов (Vicia faba L.), кукурузы (Zea mays L.), элодеи (Elodea canadensis Michx.), традесканции (Tradescancia Ruppius ex L.) уже долгое время используется для изучения цитотоксичности факторов различной природы [10, p. 115; 11, p. 24; 12, p. 191; 13, p. 398]. Чаще всего применяется для тестирования Allium cepa L. из-за высокой доли клеток, находящихся в митозе, 16 крупных (2n = 16), качественно окрашиваемых различными красителями хромосом, легкости постановки эксперимента и чувствительности [14, p. 308; 15, p. 72]. Allium-тест используется как стандартный тест для определения и оценки повреждений хромосом [16, p. 3].

Таким образом, целью работы было биотестирование проб воды со станций озера Имандра, находящихся в зоне транзита веществ, с помощью Allium-теста.

Материалы и методика исследований

Воду с опытных станций озера Имандра (губы Кунчаст, о-ва Ерм, пролива Широкая Салма, губы Зашеечная, водозабора Кольской АЭС (западный берег губы Зашеечной) отбирали с поверхности (1 м) батометром и хранили в холодильнике в специальных неадсорбирующих непрозрачных бутылках Nalgene из полиэтилена. Бутылки были тщательно обработаны в лабораторных условиях и дважды промыты водой озера непосредственно перед отбором [17, p. 69]. Отбор проб воды и донных отложений проводился в рамках мониторинга экологического состояния озера сотрудниками ИППЭС КНЦ РАН.

В эксперименте использовали лук репчатый сорта Штутгартер Ризен (2n = 16). При проведении процедуры учитывали хромосомные аберрации клеток корневой меристемы растения и митотический индекс [14, p. 318]. Луковицы предварительно проращивали 24 часа на дистиллированной воде, а затем ставили на опытные образцы воды на 96 часов в темное место при комнатной температуре. В качестве контроля была использована дистиллированная вода. Далее корни обрезали и фиксировали в фиксаторе Кларка (этиловый спирт 96%+ ледяная уксусная кислота в соотношения 3:1) на 24 часа с последующим промыванием и хранением в 80% этаноле. Окрашивание корней проводили в 1%-м ацетоорсеине. Корни помещали в керамические тигли, заливали красителем и нагревали до тайного кипения над пламенем спиртовки. После остывания тигли закрывали пленкой «Parafilm» во избежание испарения красителя и высыхания корней. Окрашивание проводили при температуре +4°C в течение 24–48 часов. Предварительной мацерацией в соляной кислоте по стандартной методике можно пренебречь, поскольку корни после обработки их опытной водой были нежными и тонкими. После окрашивания готовили давленые препараты кончиков корней 1–2 мм и проводили подсчет 1000 клеток в микроскопе.

Для расчета митотического индекса (МИ, %) брали сумму всех фаз митоза, исключая интерфазу, делили на количество подсчитанных клеток и умножали на 100%.

Данные обрабатывали в RStudio. Применяли ANOVA и критерий Тьюки. Уровень значимости был принят при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

По результатам исследования не обнаружено статистически значимых отличий в показателе митотического индекса по сравнению с контролем, однако обнаружены отличия по количеству хромосомных аберраций. Основными типами нарушений было отставание хромосом в разных фазах деления, их слипание в метафазе и ядерные почки. Одиночно встречались анафазные и телофазные мостики, С-митоз (рис. 2).

При статистической обработке результатов теста опытных образцов воды между собой различия показала станция водозабора Кольской АЭС (зап. берег губы Зашеечной) по сравнению со всеми станциями, кроме о-ва Ерм (таблица 1).

Возникающие хромосомные аберрации в клетках делятся в исследованиях на группы (анеугенные и кластогенные) [12, p. 193] и связаны либо с разрывом ДНК и распадом хромосом, либо с аномалией работы аппарата веретена деления и сниженным цитокинезом соответственно. В настоящем исследовании часто встречаемыми аберрациями были отставание и слипание хромосом и ядерные почки на фоне отсутствия снижения показателя митотического индекса, что может говорить о задержке митоза в стадии метафазы, профазы или телофазы.

Отставание хромосом/хроматид происходит из-за аномалии аппарата веретена деления клетки из-за ингибирования цитоскелетных белков и полимеризации тубулина [18, p. 2709]. Имеются данные, показывающие, что, например, тяжелые металлы (медь, никель, железо) могут как напрямую, так и косвенно влиять на генетический материал клеток, разрушая структуру ферментов, участвующих в репарации ДНК; повреждать клеточные стенки и органеллы; и нарушать механизмы деления клеток за счет повышенного окислительного стресса [19, p. 2].

 

Рисунок 2 – Хромосомные аберрации в клетках корневой меристемы Allium cepa L. после обработки водой с опытных станций оз. Имандра. А, Б, В – отставание хромосом в метафазе; Г – мост в телофазе; Д – отставание хромосом в телофазе, ядерные почки; Е – слипание хромосом (1) и отставание хромосомы в метафазе (2). Аберрации показаны стрелками. Окрашивание ацетоорсеином, увеличение ×400

 

Таблица 1 – Количество хромосомных аберраций в меристематических клетках корня Allium cepa L. после обработки водой из оз. Имандра (n = 5, всего 5000 клеток с каждой пробы и контроля)

Станция отбора проб воды	Аберрации
	Мосты	Слипание и нарушение работы веретена деления	Отставание	С-митоз	Ядерные почки	Всего
Губа Кунчаст	1	9	23	2	5	40ᵇ
О-в Ерм	2	12	26	–	8	48ᵇᶜ
Пролив Широкая Салма	1	10	34	1	–	46ᵇ
Губа Зашеечная	–	4	29	1	–	34ᵇ
Водозабор КАЭС	3	12	48	–	9	72ᶜ
Контроль (дистиллированная вода)	1	3	–	2	–	6ᵃ

Примечание. Разными буквами обозначены значения, достоверно отличающиеся в разных опытных станциях и контроле (p ≤ 0,05).

 

Слипание хромосом отображает степень токсичности химического компонента в опытной среде. Обычно слипание необратимо и часто приводит к гибели клеток. В микроскопе при таком виде аберраций можно увидеть аморфную массу (кластер) или хромосомы выглядят в виде тонких, неправильной формы, образований [20, p. 4].

Что касается механизма образования ядерных почек, то они возникают, когда химические соединения вмешиваются в процесс митотического цикла. Их образование может быть связано с процессами, следующими за отставанием хромосом, когда хромосома охватывается ядерной мембраной до того, как она присоединится к тем, которые расположены рядом с полюсом клетки [21, p. 127].

Было проведено сравнение результатов с ранее полученными при биотестировании этих же опытных станций, но проб с глубины, поскольку химический состав поверхностных и глубинных вод может значительно отличаться. Биотестирование показало идентичные, достоверно отличающиеся от контроля и станций в зоне транзита, веществ (пролив Широкая Салма, о-в Ерм, губа Зашеечная) и относительного фона (губа Кунчаст), результаты по наличию хромосомных нарушений у тест-системы A. cepa в точке водозабора Кольской АЭС.

Биотестирование станций, рассматриваемых в работе, на культуре мухи дрозофилы меланогастер (Drosophila melanogaster Meigen) показало отставание по высоте расположения пупариев над средой во всех станциях по сравнению с контролем и задержку прохождения стадий развития от личинки до имаго, что также может говорить о влиянии веществ из воды на тестовый организм [22, с. 232].

Полученные данные двух биотестов согласуются с данными многолетних исследований воды, донных отложений и биоиндикационных исследований озера ИППЭС КНЦ РАН (в сотрудничестве с Институтом геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского РАН, Институтом геологии Карельского научного центра РАН и другими организациями) и конкретно относительно фоновых и станций транзита веществ. В воде с исследуемых станций обнаружены превышающие фоновые концентрации среднего показателя меди (до 3 мкг/л), никеля (от 2 до 99 мкг/л, в среднем 8,6 мкг/л в Большой Имандре и от 1,1 до 6,3 мкг/л, в среднем 2,2 мкг/л в Бабинской и Йокостровской Имандре). Также загрязняющими элементами являются стронций, алюминий и марганец. Медь и никель поступают в воды в результате деятельности АО «Кольская ГМК» вблизи г. Мончегорска. Содержащие эти металлы сточные воды преодолевают около 52 км до Кольской АЭС и 74 км до ее подводящего канала. Стронций (его содержание в губе Кунчаст достигало 44,2 мкг/л в 2018 г.) и алюминий (24,9 мкг/л в губе Кунчаст на 2018 г.) с водными массами мигрируют с АО «Апатит» (г. Апатиты и г. Кировск) около 40 км до подведения к АЭС и затем вливаются в Бабинскую Имандру [5, с. 104; 17, p. 69; 23, с. 97; 24, с. 41].

Биоиндикационные исследования также показали перестройку диатомовых комплексов из-за антропогенного воздействия частично в станциях Бабинской Имандры и в станциях, непосредственно испытывающих загрязнение (Йокостровская и Большая Имандра). Биоиндикационные ихтиологические исследования также показали перестройку сообществ рыб [25, с. 78; 26, с. 219].

Таким образом, в настоящее время в озере происходят перестройки сообществ живых организмов, процессы диагенеза [17, p. 77], которые ещё долгое время будут приводить колебанию содержания химических элементов в воде и донных отложениях, несмотря на снижение темпов техногенной нагрузки.

Выводы

Анализ на тест-модели A. cepa показывает возникновение хромосомных аберраций после воздействия воды с опытных станций оз. Имандра по сравнению с контролем. Вода со станции водозабора Кольской АЭС статистически значимо отличается как от контроля, так и от остальных станций (кроме о-ва Ерм), включая условный фон (губа Кунчаст). При сравнении полученных данных с данными биотеста проб с глубины выясняется идентичное действие воды на деление клеток меристемы A. cepa. Биотест на основе Дрозофилы меланогастер также показывает достоверное влияние воды с взятых станций на прохождение жизненного цикла мухой. Тестовые модели A. cepa и Drosophila melanogaster показали себя чувствительными тест-моделями.

Сопоставление результатов биотестирования с данными химического анализа и биоиндикационными исследованиями ИППЭС КНЦ РАН демонстрирует, в целом, сходные характеристики изучаемых станций отбора проб воды. Бабинская Имандра является наиболее сохранившим свои природные характеристики плесом, однако вследствие переброса в него через Кольскую АЭС загрязненных вод Йокостровской Имандры, испытывает опосредованное антропогенное влияние. Таким образом, в озере происходят перестройки сообществ и гидрохимических процессов на фоне долговременного антропогенного воздействия и изменения климата.

Следовательно, биотестирование представляет собой эффективный метод изучения экологического состояния объектов окружающей среды вместе с химическим анализом и биоиндикационными исследованиями. Такой подход является комплексным, показывающим воздействие факторов на все аспекты изучаемого объекта, и носит название Триадного. В настоящее время такая методология чаще применяется для оценки экологического состояния почв [27, с. 592], но вполне может применяться и для водных источников [28, p. 155].

About the authors

Mariya Vasilevna Smirnova

Research Centre for Human Adaptation in the Arctic – Branch of the Kola Science Centre of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: m.smirnova@ksc.ru

researcher of Medical and Biological Technologies Laboratory

Russian Federation, Murmansk Region, Apatity

Dmitrii Borisovich Denisov

Institute of North Industrial Ecology Problems – Subdivision of the Kola Science Centre of the Russian Academy of Sciences

Email: d.denisow@ksc.ru

candidate of biological sciences, leading researcher of Water Ecosystem Laboratory

Russian Federation, Murmansk Region, Apatity

References

Supplementary files