Analysis of the effect of ultra-low concentrations of benzimidazole on the adaptation of Phalaenopsis amabilis (L.) Blume protocorms

Full Text

В настоящее время накоплен достаточно большой опыт выращивания тропических и субтропических орхидей в искусственных условиях [1–3].

Успешное культивирование семян орхидных в условиях in vitro во многом зависит от сбалансированного состава питательной среды, содержащей макро- и микроэлементы, углеводы, витамины и регуляторы роста в нужном количестве. Часто при культивировании орхидных используются аналоги растительных гормонов, многие из которых проявляют генотоксичность, в том числе и для людей, даже в малых дозах. Исходя из этого актуальным является совершенствование методик культивации и поиск эффективных, недорогих и безопасных стимуляторов. Совершенствование методик представляет не только научный интерес, но и практический. Известно, что средняя оптовая цена на импортные фаленопсисы сейчас составляет 1,5 тыс. руб., розничная – около 2 тыс. руб.

Существует несколько основных методов массового размножения орхидных в культуре: семенное (симбиотическое и асимбиотическое), меристемное, черенкование и размножение почками.

Семенное размножение орхидных имеет как преимущества, так и сложности. Преимуществом такого способа получения новых растений является их генетическое разнообразие, что необходимо для поддержания полиморфизма в популяциях, что важно для сохранения биоразнообразия видов, а также для селекции. Кроме того, некоторые виды орхидных крайне сложно размножать вегетативно. Семенное размножение к тому же снижает риск распространения вирусных инфекций, в отличие от вегетативных методов.

Однако, при семенном размножении орхидных возникает ряд сложностей. Это, в первую очередь, получение самих полноценных семян, так как у орхидных крайне редко встречается самоопыление, и они используют различных насекомых опылителей.

К сложностям размножения орхидных относятся особенности их онтогенеза – способность к семенному размножению в дикой природе у многих видов орхидных наступает только в возрасте 8–12 лет, а также то, что семена орхидных имеют крайне мелкий размер, лишены питательных веществ и для прорастания им необходимы грибы-симбионты, то есть на ранней стадии развития орхидеи микогетеротрофны [4–6].

В начале XX века была открыта возможность выращивания орхидей из семян, заражая их эндофитным грибом от материнского растения, таким образом решая проблемы с питательными веществами для семян [7]. Минусами данной методики является низкий показатель всхожести семян и сложности с подбором специальных штаммов грибов и их культивирования [8].

Прорывом в области культивирования орхидных стало создание искусственных питательных сред Люисом Кнудсоном в 1922 году. Предложенный им метод подразумевал посев семян на питательные среды, способных полностью заменить семенам питание, получаемое от грибов. При правильном подборе сред всхожесть достигает 90%.

Однако необходим подбор среды для каждого вида орхидей (полностью универсальной среды для всех орхидных быть не может), а также поддержание стерильных условий (питательные среды легко заражаются бактериями и грибами) [9].

Современные методики культивирования орхидных подразумевают использование различных химических соединений, способных стимулировать рост и развитие растений, а также защищать их от различных инфекций [9].

Самая обширная группа соединений, используемых при культивировании веществ, – стимуляторы роста, фитогормоны (ауксины, цитокинины, гиббереллины) и их аналоги (ИУК – индол-3-уксусная кислота, НУК – нафтилуксусная кислота, ИМК – индол-3-масляная кислота, кинетин, 6-БАП – 6-бензиламинопурин, тидиазурон – TDZ, GA3 – гибберелловая кислота) [8–10].

При культивировании орхидных так же используют антибиотики и фунгициды, для предотвращения заражения растений бактериями и грибами. Самыми распространёнными фунгицидами являются такие препараты как: «Беномил» («Фундазол») – 0,1% (против Fusarium Link), «Каптан» – 0,2% (для субстрата), «Фитоспорин-М» – биопрепарат на Bacillus subtilis Cohn.; а антибиотиками (in vitro) – стрептомицин – 50–100 мг/л и гентамицин – 10–20 мг/л [8; 9].

Список вспомогательных веществ при культивировании орхидных велик и продолжает расширяться в связи с тем, что одной из задач биотехнологии культивирования является поиск стимуляторов роста с высокой избирательной активностью.

Перспективным в этом отношении является бензимидазол. Бензимидазол – гетероциклический азол, входящий в состав синтетических фунгицидов, например, в составе препаратов «Беномил» или «Карбендазим».

Исследования последних лет показали, что некоторые производные бензимидазола проявляют цитокинин-подобную активность, то есть способны стимулировать деление клеток и пробуждать боковые почки у растений. Важно отметить то, что цитокинин-подобная активность бензимидазолов проявляется при сверхнизких концентрациях (концентрации 0,0001%). При этом данные соединения являются менее токсичными для растений и животных (в том числе человека) в сравнении с широко используемым 6-бензиламинопурином (6-БАП) [11–13]. Немаловажным является то, что некоторые бензимидазолы проявляют свойства адаптогена, например, дибазол, то есть способны индуцировать экспрессию генов, отвечающих за системную устойчивость растений. Было показано, что обработка препаратами на основе бензимидазола увеличивала всхожесть, рост и улучшила устойчивость к стрессу сеянцев разных сельскохозяйственных культур [14].

Биологическая активность бензимидазолов заключается в том, что они активируют различные механизмы адаптации, заключающиеся в активации ферментов, отвечающих за оптимизацию клеточного метаболизма в условиях стресса переживаемого растения. Многочисленные исследования показали, что различные химические группы, присоединяемые различными способами к бензимидазольному кольцу, придают соединению самые различные активности [15].

Объектом настоящего исследования стали семена гибрида Phalaenopsis amabilis (L.) Blume, полученные в ходе искусственного опыления комнатных растений.

Семена во вскрывшейся коробочке стратифицировали в холодильнике при +4°C в течение 4 месяцев, после чего их стерилизовали и скарифицировали.

Для проращивания семян использовали метод асимбиотического культивирования орхидных, на среде «Кнудсон C». Считается, что эта среда наиболее подходит для культивирования фаленопсисов [16].

Мы произвели некоторые модификации среды для получения максимальной всхожести семян.

Было приготовлено 4 варианта среды.

1. Среда «Кнудсон C», служившая контролем.
2. Среда «Кнудсон C» с добавлением активированного угля (1 г/л), как фактор уменьшения продуктов метаболизма растущих организмов, способных сдерживать их развитие.
3. Среда «Кнудсон C» с добавлением бензимидазола в концентрации 0,0001 мг/мл.
4. Среда «Кнудсон C» с добавлением бензимидазола в концентрации 0,0001 мг/мл и активированного угля (1 г/л).

После приготовления варианты питательной среды разливали по жаростойким фласкам и стерилизовали в автоклаве.

Посев семян осуществлялся в стерильном боксе. После чего фласки плотно закрывались стерильной пробкой из ваты.

После посева фласки с семенами были перенесены в тёмное место на 7 суток, по истечению данного времени фласки проверяли на заражение среды бактериями или плесневыми грибами и переносили в место дальнейшего культивирования, где затем их проверяли еженедельно на чистоту от заражения (рис. 1).

По мере роста протокормов производили пересадку, чтобы избежать гибели части образовавшихся протокормов на фоне конкуренции за питательную среду и пространства во фласках. Питательная среда со временем частично подсыхала, что также являлось причиной пересадки протокормов (рис. 2).

В ходе эксперимента наблюдали заражение некоторых культур во фласках бактериями и плесневыми грибами, что также служило причиной пересадки протокормов.

В ходе культивирования еженедельно фиксировали состояние и уровень развития протокормов.

Обнаружили разницу в темпе образования листьев во всех вариантах эксперимента. Так, на среде с углём и на среде с бензимидазолом образование листьев началось значительно раньше, на 22-й неделе культивирования, в то время как в контроле и на среде с углём и бензимидазолом это было отмечено лишь на 26-й неделе (рис. 3).

Динамика развития корней в разных вариантах эксперимента показало схожесть с динамикой развития листьев. В среде углем и в среде с бензимидазолом образование первых корней было отмечено к 24-й неделе культивирования, тогда как в контроле к 27-й неделе культивирования (рис. 4). Среда с добавлением угля и бензимидазола оказала наиболее стимулирующее действие на развитие корней – их появление в этом варианте отмечено на 22-й неделе. Темп образования новых корней и их рост достоверно (для p > 0,05) выше в модифицированных средах, чем в контроле.

Таким образом, к 32-й неделе эксперимента наблюдали достоверное (для p > 0,05) различие в развитии проростков (рис. 5). В контроле только 40% протокормов образовали листовые пластинки и 17% – корни, тогда как в вариантах модифицированных сред с бензимидазолом более 93% протокормов образовали листовые пластинки и более 41% – корни, что говорит о стимулирующем действии бензимидазола в концентрации 0,0001 мг/мл на проростки.

 

 

Необходимо отметить более высокие темпы образования листьев и корней у проростков на питательной среде с углём в сравнении с контролем без угля. Что, по-видимому, связано с антитоксическим эффектом угля, так как проростки выделяют в среду фенольные соединения (такие как орхинол, хиноны, флавоноиды, нужные для аллелопатии и защиты от патогенов), которые со временем, вероятно из-за накопления в питательной среде, начинают оказывать на них негативное влияние [17]. Также обнаружили, что развитие корней на средах с добавлением угля идет скачкообразно, по сравнению со средами без добавления угля, где проростки развивались более равномерно. Этот факт, на наш взгляд, требует дальнейших исследований.

Подводя итог, можно сказать, что сочетание питательной среды с бензимидазолом и углём показало наилучший результат, как для образования числа и размеров листьев, так и для образования корней в сравнении с остальными вариантами эксперимента.

Появление первого ювенильного растения (растения с двумя полноценными листьями), было нами отмечено на месяц раньше в среде с добавлением бензимидазола, чем в контроле.

К окончанию эксперимента – 32-я неделя культивирования, отмечено, что проростки на среде с бензимидазолом выглядят более крупными и развитыми, чем в контроле (рис. 6). Это ещё раз подчёркивает активное воздействие бензимидазола на развитие орхидей.

Таким образом, можно заключить, что использование бензимидазола в сверхнизких концентрациях оказывает стимулирующее действие на развитие протокормов орхидных, а дальнейшее изучение по влиянию как бензимидазола, так и его производных на рост и выживаемость орхидных представляется перспективным направлением работы с целью быстрого получения культур орхидных.

About the authors

Elizaveta Andreevna Guseva

Samara National Research University

Email: evvvvve6342@gmail.com

student of Biological Faculty

Russian Federation, Samara

Yana Andreevna Bogdanova

Samara National Research University

Author for correspondence.
Email: bogdanova.yaa@ssau.ru

assistant of Ecology, Botany and Nature Protection Department

Russian Federation, Samara

Ekaterina Sergeevna Selezneva

Samara National Research University

Email: catana7@yandex.ru

candidate of biological sciences, associate professor of Biochemistry, Biotechnology and Bioengineering Department

Russian Federation, Samara

Zoya Petrovna Belousova

Samara National Research University

Email: zbelousova@mail.ru

doctor of chemical sciences, associate professor, professor of Inorganic Chemistry Department

Russian Federation, Samara

References

Supplementary files